Nachweis Proteinkinase C abhängig exprimierter Gene in Astrozytomen

Die Proteinkinase C (PKC) ist eine wichtige Signaltransduktionskomponente, deren Aktivierung die Expression zahlreicher Gene induziert und zur Zelldifferenzierung und Zellproliferation führt. Ein besonders hohes Expressionsniveau der PKC findet man in vielen Tumoren. So korreliert in malignen Gliazellen das Expressionsniveau der PKC mit deren Wachstumsgeschwindigkeit. Es wird angenommen, daß die aktivierte PKC eine wichtige Rolle in der Tumorpromotion hat. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob in Astrozytomzellinien Gene zu finden sind, die nach PKC-Aktivierung durch den Phorbol-Ester TPA differentiell exprimiert werden. Zunächst wurden kultivierte Zellen der Astrozytomzellinie LN-405 mit TPA respektive dem PKC-Inhibitor Chelerythrin behandelt. Nach Gewinnung der mRNA aus der zuvor isolierten RNA wurden in einem mehrstufigem PCR-Verfahren (SSH) cDNA-Abschnitte gewonnen, die zu vermeintlich differentiell exprimierten Genen gehören. Diese cDNA-Abschnitte wurden in Plasmid-Vektoren eingefügt, kloniert und zur Bestimmung sequenziert. Um falsch positive Sequenzen zu erkennen, wurden die zuvor radioaktiv markierten cDNA-Abschnitte mit Northernblots hybridisiert. Gleichzeitig ließ sich so ein zeitabhängiger Anstieg der Expression nach PKC-Stimulation untersuchen. Durch den PCR-Select-Assay (SSH) konnten insgesamt 11 Gene gefunden werden, die sich in der radioaktiven Northernblot-Hybridisierung, als nach PKC-Aktivierung differentiell exprimiert, darstellen ließen. Dabei bestätigt der gefundene Zusammenhang zwischen PKC-Aktivierung und differentieller Exprimierung bei fünf der 11 Gene (IL-8, Calpain, Interferon-gamma Rezeptor 2, Methionin Adenosyltransferase, beta-2 adrenerger Rezeptor) Ergebnisse anderer Autoren, wobei dieser Zusammenhang nur bei zwei Genen (IL-8 und Calpain) auch in Astrozytom- bzw. Gliom-Zellen schon früher gezeigt werden konnte. Sechs Gene (M-Phase Phosphoprotein-1, ect2-Onkogen, ERM-Gen, Ornithin-Decarboxylase-Antizym 2, MHC-bindendes Protein 2, Sequenz aus Cosmid F0811) wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig als PKC-abhängig exprimiert beschrieben. Die gefundenen Gene haben auf verschiedene Funktionen der Zellen Einfluß. So beeinflussen sie die Regulation des Zellzyklus (MPP1, ect2-Oncogen), die Immunregulation (MBP-2, IL-8, Interferon-gamma Rezeptor 2), die Signaltransduktion (beta-2 AR), die Transkription (ERM-Gen), die Proteinsynthese (ODC-Antizym, MAT), die Wachstumskontrolle (ODC-Antizym) und die Regulation der PKC selbst (Calpain). Für fünf Gene läßt sich ein eindeutiger Zusammenhang mit der Tumorpromotion herstellen: IL-8 (Angioneogenese), MBP-2 (Immunsuppression), ERM-Gen (Transkriptionspromotion), MAT (allgemein fördernder Einfluß auf den Metabolismus) und ect2-Oncogen (Oncogen).The protein kinase C (PKC) is one of the major signal transduction systems and its activation leads to the induction of the expression of several genes, to cell differentiation and cell proliferation. Very high expressed PKC are found in many tumors. In malignant glia cells the expression of PKC correlates with their proliferation rate. The PKC activity has an important role for the tumor promotion. The object of this paper, was to investigated, if there are genes differentialy expressed after activation of PKC through the phorbol-ester TPA in astrocytoma cell lines. The astrocytoma cell line LN-405 was incubated with TPA and the PKC-inhibitor chelerythrine respectively. After isolation of RNA and mRNA the suppression subtractive hybridization (SSH) was used to isolate differentially expressed cDNA fragments. These cDNA fragments were inserted into the T/A cloning vector, cloned and sequenced. To detect false positives the cDNA fragments were analysed with northern blot technique. Examined was also a time-dependent acceleration of expression after TPA treatment. 11 genes were detected by suppression subtractive hybridization, showing differentially expressed in the northern blot hybridization. Five of the genes were found differentially expressed after PKC activation before (IL-8, calpain, interferon gamma receptor 2, beta-2-adrenergic receptor, methionine adenosyltransferase alpha), two of these genes (IL-8, calpain) also in astrocytoma- and glioma-cells respectively. Six genes (M-phase phosphoprotein 1, ect2-onkogene, erm gene, ornithine decarboxylase antizyme 2, MHC binding protein 2, sequence from Cosmid F0811) were described as PKC dependent expressed for the first time. The genes detected influence several cell functions. They are involved in cell-cycle regulation (MPP1, ect2-oncogene), immuneregulation (MBP-2, IL-8, interferon gamma receptor 2), signal transduction (beta 2 adrenergic receptor), transcription (erm-gene), synthesis of proteins (ODC-antizyme 2, MAT), growth control (ODC-antizyme) and regulation of PKC (Calpain). Five genes show a clear connection to tumor promotion: IL-8 (angioneogenesis), MPB-2 (immunesuppression), erm gene (promotion of transcription), MAT (promotion of metabolism) and ect2-oncogene (oncogene)