Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

Apoptose spielt eine wichtige Rolle bei der Generierung eines funktionellen Lymphozytenrepertoirs. Während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose werden potentiell autoreaktive Zellen eliminiert. Da die molekularen Mechanismen der B-Zell Apoptose weitgehend unbekannt sind, sollten in dieser Arbeit assoziierte Proteine und Gene identifiziert werden. Durch Subklonierung wurde eine Burkitt Lymphom B Zellinie BL60-2 generiert, die sensitiv auf den anti-IgM Stimulus ist. Für den Vergleich apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen wurde eine Methode entwickelt in der apoptotische, Phosphatidylserin (PS) positive Zellen, über eine magnetische Separation mit einer Reinheit von bis zu 95 Prozent von nicht apoptotischen Zellen angereichert werden konnten. Mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese wurden die aufgereinigten Fraktionen apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen analysiert und die Proteinmuster verglichen. Anhand massenspektrometrischer Analysen und Edman Abbau konnten bisher folgende differentiell erscheinende Proteinspots identifiziert werden: Lamin B1, b-Aktin, neutrales Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, das FUSE-binding Protein, dUTPase, P0, HP1 a. Die Proteine D4-GDI, hnRNPA1 und der Transkriptionsfaktor SP1 werden spezifisch während der anti-IgM induzierten Apoptose gespalten. Der zeitliche Verlauf wurde in einer eindimensionalen Western Blot Analyse bestimmt. Das diese Spaltungen ein Resultat der Aktivierung der Proteasen der Caspase 3 Familie sind, konnte durch Inhibitor Studien mit dem Tetrapeptid z-DEVD-fmk bewiesen werden. Die Spaltung des Transkriptionsfaktors SP1 wurde ebenfalls in in vitro untersucht. Rekombinante Caspase 3 und 7 generieren die gleichen Spaltprodukte, die zuvor in vivo nach anti-IgM induzierter Apoptose detektiert wurden, Caspase 6 hingegen generiert nur ein Fragment. Die spezifische Spaltung des Transkriptionsfaktors beinflußt die DNA Bindungsaktivität, was in einem elektro mobility shift assay gezeigt werden konnte. Die Intensität des SP1/DNA-Komplexes nimmt nach Apoptose-Induktion stark ab, hingegen nimmt die Intensität eines kleineren Komplexes stark zu, was auf die Bindung eines der Spaltprodukte schließen ließ, das möglicherweise transkriptionell inaktiv ist und damit einen wichtigen Apoptose Effektor darstellt. Die Proteasen der Caspase 3 Familie konnten erstmalig als zentrale Regulatoren während der anti-IgM induzierten Apoptose identifiziert werden. Durch die Hemmung mit dem Inhibitor z-DEVD-fmk konnte die Apoptose, sowie charakteristische morphologische Veränderungen, wie die Kernfragmentierung und PS auf die Zelloberfläche gehemmt werden und als Caspase 3 abhängige Veränderungen bestimmt werden. Über verschiedene Methoden der differentiellen Hybridisierung von neu hergestellten l-Zap cDNA-Phagenbanken von nicht stimulierten und anti-IgM stimulierten Burkitt Lymphom Zellen sowie der subtraktiven Klonierung sollten Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten Apoptose differentiell exprimiert werden. Apoptose spezifische Sequenzen wurden angereichert, kloniert und sequenziert.Apoptosis or programmed cell death is essential in the process controlling lymphocyte growth and selection. During anti-IgM induced B cell apoptosis autoreactive cells are eliminated. Since the molecular mechanisms underlying the process of B cell apoptosis are still not well understood the goal of this study was to identify proteins and genes in apoptosis. Subcloning lead to the selection of a human Burkitt lymphoma B cell line clone (BL60-2) which is highly sensitive towards the anti-IgM stimulus. In order to compare apoptotic and non apoptotic cells a novel method was established, which allows separation of apoptotic, Phosphatidylserine (PS) positive cells from non apoptotic, PS negative cells by magnetic cell sorting. This method generates fractions of apoptotic and non apoptotic cells with a purity of up to 95 %. Cell lysates from those fractions were analyzed using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and the protein patterns were compared. Using mass spectrometry and Edman sequencing the following differentially appearing proteins were identified: Lamin B1, b-Actin, neutral Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, FUSE-binding protein, dUTPase, P0, HP1 a. The specific cleavage of the D4-GDI, hnRNPA1 and the transcription factor SP1 which occurs after anti-IgM induced apoptosis was detected by western blot analysis. It was determined by inhibition studies with the tetrapeptide inhibitor z-DEVD-fmk that the cleavage is a result of the Caspase 3 family. Cleavage of the transcription factor SP1 was also investigated by in vitro cleavage assays. The activity of recombinant caspase 3 and 7 generate the same cleavage products as observed in vivo after anti-IgM induction. The specific cleavage of the transcription factor influences it´s DNA binding activity as observed by the decrease of the full lenght protein-DNA complex. The increase of a smaller protein-DNA complex was apparent, which may represent the binding of at least one cleavage product. In this work proteases of the Caspase 3 family could be identified as central regulators during anti-IgM induced apoptosis. Anti-IgM induced apoptosis can be completly inhibited by inhibition of Caspase 3 proteases. Characteristic morphological changes, nuclear fragmentation and PS translocation to the outer membrane leaflet of the cells could be determined as a consequence of the Caspase 3 activation during the process of apoptosis. By differential hybridisation of newly generated l-Zap c-DNA librarys from unstimulated and anti-IgM stimulated B cells as well as with subtractive cDNA librays, it should be feasable to identify newly transcribed genes. Apoptosis specific sequences were enriched, cloned and sequenced