Identificação de proteínas alvo do H2O2 nas células endoteliais

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011As espécies reactivas de oxigénio (ERO) estão normalmente associadas ao stress oxidativo, levando a senescência e a morte celular. Contudo, nos últimos anos tem-se vindo a revelar um papel determinante destas espécies na regulação de funções fundamentais para as células, quando presentes em baixas concentrações. O H2O2 e um dos sinalizadores mais importantes das ERO, e nas células endoteliais (CE) esta associado a processos de migração, proliferação e sobrevivência, eventos críticos para a angiogenese. A regulação de vias de sinalização pelo H2O2 esta associada a modificações de oxidação nos resíduos de cisteínas reactivos de proteínas. Com o objectivo de identificar proteínas alvo do H2O2 em CE, procedeu-se ao estudo do proteoma das cisteínas sensíveis a oxidação quando expostas a concentrações sub-letais de H2O2 , pelo método de titulação de H2O2 em estado estacionário. Extractos proteicos totais obtidos a partir de CE foram separados por electroforese bidimensional e analisados quanto a variação na oxidação e na expressão de proteínas. Neste trabalho identificaram-se três proteínas que apresentam um aumento de oxidação significativo, a ciclooxigenase 2, a proteína zinc finger 646 e a proteína 40S ribossomal SA e duas com aumento de expressão, a peroxiredoxina 1 e a ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 24. Uma vez que a activacao da via de sinalização do VEGF induz a produção de H2O2, analisou-se também o proteoma das cisteínas reactivas apos tratamento das CE com este factor de crescimento. As células endoteliais são componentes chave de varias doenças que se caracterizam pela disfunção do processo angiogenico, como o cancro, diabetes e doenças isquémicas. A descoberta de proteínas responsáveis pela regulação endotelial cuja função e modulada pelo H2O2, pode revelar novos alvos para o desenvolvimento de terapias mais eficientes.Reactive oxygen species (ROS) are usually associated with cytotoxic and mutagenic effects ultimately leading to cell death and senescence. However, it has been shown in the last few years that ROS have a main role in the regulation of essential cell functions when present at low levels. H2O2 is well established as a signaling molecule among ROS, and in endothelial cells (EC) is responsible for the regulation of cellular migration, proliferation and survival, which are critical events for the angiogenic process. H2O2 is able to modulate protein function by the oxidation of particular cysteine residues. This work aimed to identify H2O2 target proteins in EC by the analysis of the reactive thiol proteome after the exposure to sub-lethal concentrations of H2O2 using the steady state titration method. Variations in oxidation and protein expression were determined after analysis of total protein extracts in bidimensional electrophoresis. The results have shown increased oxidation of ciclooxigenase 2, zinc finger protein 646 and 40S ribossomal SA protein and increased expression of other two proteins, peroxiredoxin 1 and ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 24. Since the activation of VEGF signaling pathway induces H2O2 production, it was also analyzed the reactive thiol proteome of EC after treatment with this growth factor