Fibrinogen chaperone activity in transthyretin amyloidosis: the effect of protein glycation

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A Amiloidose da Transtirretina (ATTR), também conhecida como Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), é uma doença neurodegenerativa hereditária que se caracteriza pela deposição extracelular de fibras amilóides, em particular no sistema nervoso periférico. A primeira descrição desta amiloidose foi feita em 1952 por Corino de Andrade, numa população do norte litoral de Portugal. Fenotipicamente a doença manifesta-se inicialmente com a perda de sensibilidade nos membros dos doentes, seguida de atrofia muscular, incapacidade motora e morte 10 a 20 anos após o início das primeiras manifestações.O principal constituinte das fibras amilóides é a transtirretina (TTR), uma proteína extracelular tetramérica encontrada no plasma e fluido cerebrospinal. O tetrâmero é composto por 4 subunidades idênticas de 14 kDa, sendo a TTR maioritariamente expressa e secretada a partir do fígado. Actualmente, não existe nenhuma abordagem terapêutica que se apresente como uma solução permanente para tratar a ATTR. Porém, através da realização de um transplante hepático é possível atenuar a progressão da ATTR em doentes que manifestam os sintomas desta patologia. São conhecidas mais de 80 mutações no gene da TTR, que conferem carácter amiloidogénico à proteína e que estão associadas esta doença, sendo a maioria delas substituições pontuais na cadeia peptídica. A mutação mais comum na ATTR é a TTR V30M (em que a Valina na posição 30 é substituída por uma Metionina), a qual se encontra dispersa de forma esporádica a nível mundial, mas está principalmente associada às áreas endémicas de Portugal, Japão e Suécia.O modelo mais aceite para descrever a patogénese desta doença, fundamentado em estudos in vitro, assenta na perda de estabilidade do tetrâmero da TTR devido à ocorrência de mutações pontuais na sua cadeia polipeptídica, que levam à sua destabilização em monómeros parcialmente desnaturados que se associam em agregados, culminando na formação de fibras amilóides compostas por TTR. No entanto, existem diversas observações fenotípicas que contradizem alguns dos pressupostos do modelo sugerindo um mecanismo in vivo mais complexo, envolvendo elementos que - juntamente com as mutações pontuais -, influenciam a manifestação e progressão da ATTR. A título de exemplo, para indivíduos que possuem a mesma mutação no gene da TTR incluindo gémeos monozigóticos, foi observado uma grande diversidade no início das manifestações clínicas da ATTR, podendo mesmo variar em décadas. Existem ainda diferenças geográficas no que toca à manifestação dos sintomas e na própria morfologia dos agregados. Ao contrário do expectável, indivíduos homozigóticos para genes de TTR mutada não apresentam uma forma mais agressiva da doença. Por detrás destas diferenças poderão constar outros elementos, para além da desestabilização do tetrâmero da TTR que podem influenciar o fenótipo patológico associado à doença. Os mecanismos moleculares mais importantes que podem afectar directamente a estrutura e função das proteínas são interacções proteína-proteína e modificações pós-traducionais. A TTR tem dois ligandos principais no plasma, conhecidos como a T4 (tiroxina) e a RBP (do inglês, Retinol Binding Protein). Mais recentemente foram também identificados no plasma novos interactuantes da TTR. Destes, o fibrinogénio surge com particular interesse, uma vez que foi também recentemente descrito como chaperone extracelular. O fibrinogénio é uma glicoproteína de múltiplos domínios, tendo uma massa de aproximadamente 340kDa, sendo constituído pelas cadeias Aα, Bβ e γ. Esta proteína sintetizada no fígado é geralmente associada ao fenómeno de associação da fibrina e coagulação sanguínea, no entanto a sua descrição como chaperone extracelular denuncia a relevância da sua interacção com a TTR in vivo. Recentemente foram identificadas no proteoma plasmático de doentes com ATTR proteínas diferencialmente glicadas. A glicação proteica é uma modificação pós-traducional irreversível e não enzimática, onde os grupos amina das cadeias laterais de argininas e lisinas reagem com compostos com grupos carbonilo, dando origem a produtos avançados de glicação (AGEs). O metilglioxal é (MG) é o agente de glicação in vivo mais importante, formado nas células principalmente a partir dos intermediários da via glicolítica. Foi observado que chaperones podem ser alvos específicos desta modificação não-enzimática, resultando na modulação da sua função e actividade. A glicação foi anteriormente descrita como estando implicada em outras doenças conformacionais, tais como a doença de Alzheimer e de Parkinson. A hipótese de trabalho que foi estabelecida para este estágio sugere que outros factores – para além da destabilização do tetrâmero de TTR - contribuem para o fenótipo patológico associado com a doença, de forma directa ou indirecta. Assim, propõe-se que alterações na homeostase proteica normal (proteostase) no espaço extracelular possam contribuir para a progressão da ATTR. Embora várias moléculas sejam relevantes para o estudo das doenças amilóides, uma vez que fibrinogénio é um interactuante da TTR com função de chaperone, foi a proteína de eleição para testar a hipótese de trabalho. Além disso, dada a influência do envelhecimento e/ou stress metabólico com uma proteostase em desequilíbrio, decidiu-se estudar o possível envolvimento da glicação na ATTR.Neste trabalho realizaram-se ensaios de agregação e formação de fibras realizados na presença de fracções de fibrinogénio enriquecidas a partir de plasma de indivíduos saudáveis e doentes ATTR. Observou-se uma diferença nítida na actividade de chaperone entre as fracções de fibrinogénio de indivíduos saudáveis e ATTR. Uma vez que a glicação induzida in vitro inibe a actividade de chaperone do fibrinogénio, verificou-se que estes indivíduos apresentam perfil de glicação diferencial para esta molécula. Além disso, perfil de glicação do fibrinogénio foi caracterizado com recurso à espectrometria de massa. Encontrou-se uma distribuição espacial diferencial para a glicação em fibrinogénio de pacientes ATTR em relação a indivíduos saudáveis. Este padrão de glicação diferencial pode estar correlacionado com a diminuída actividade de chaperone do fibrinogénio em indivíduos ATTR. Estas observações apoiam fortemente o fibrinogénio como um elemento importante no mecanismo de patogénese ATTR.Em suma, nesta dissertação é descrita a função anormal de um elemento do espaço extracelular que está envolvido na monitorização de conformação de proteínas e concentração – o fibrinogénio. A função diminuída deste chaperone é correlacionada com uma alteração metabólica – a glicação. Assim, propõe-se uma alternativa para o modelo real para a patogénese ATTR onde outros elementos, para além da desestabilização do tetrâmero de TTR, podem influenciar o fenótipo patológico associado com a doença. Estes factores adicionais incluem distúrbios mecanismos celulares, tais como alterações metabólicas - glicação, stress oxidativo, etc. - e uma homeostase proteica desequilibrada, em que a actividade de certas proteínas deficientes, tais como o fibrinogénio e outros elementos importantes (por exemplo, chaperones) podem conduzir a uma manifestação progressiva da amiloidose de transtirretina.Transthyretin Amyloidosis (ATTR), also known as Familial Amyloidotic Polyneuropathy (FAP) is an autosomal inherited neurodegenerative disorder in which the neuropathological hallmark is the extracellular deposition of amyloid fibrils on the peripheral nervous system. Transthyretin (TTR), an extracellular tetrameric protein found in serum and cerebrospinal fluid, constitutes the major component of these amyloid fibers. TTR has several known ligands, but recently a few more were identified as interacting partners. From these, fibrinogen arises with particular interest since it has been recently described as a chaperone. Moreover, this protein was also identified as differentially glycated in ATTR patients. It is well documented that chaperones are specific targets of this non-enzymatic modification, resulting in their function and activity modulation. Also, glycation was previously described as being involved in other conformational diseases, such as Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. In this work aggregation and fiber formation assays were performed in the presence of fibrinogen from healthy and ATTR patients’ plasma. We could observe a clear difference in the chaperone activity between fibrinogen enriched fractions from healthy and ATTR subjects. Since these individuals show different glycation profile and in vitro glycation hampers fibrinogen chaperone activity, we further engaged fibrinogen fibrinogen’s glycation profile characterization resorting to mass spectrometry. We found a dissimilar spatial glycation pattern in fibrinogen from ATTR patients regarding healthy individuals. These observations strongly support that fibrinogen is a likely player in the mechanism of ATTR pathogenesis