Produção e caracterização de quitinases ácidas de macieira em Pichia Pastoris

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011Este trabalho visou a clonagem e expressão de genes codificadores de quitinases ácidos de classe III de macieira no sistema heterólogo Pichia pastoris, nas estirpes GS115 e KM71H. Prepararam-se três construções com três genes já anteriormente identificados (C525, C209 e C203) e o sinal de secreção α-factor de S. cerevisiae, e duas construções com os genes C525 e C209 com o sinal de secreção nativo. Estas construções foram clonadas no vector pPICZαA e introduzidas na levedura. Obtiveram-se colónias positivas para todas as construções, excepto para a C209 com o sinal de secreção nativo, sugerindo uma análise de Southern a presença de apenas uma cópia da construção em cada recombinante. Após indução da expressão com metanol, mediu-se, em vários momentos, o crescimento e o teor total de proteína das culturas, bem como a actividade quitinolítica do secretoma das colónias recombinantes, usando glicolquitina como substrato. Seleccionaram-se as construções que apresentaram, pelo menos numa estirpe, actividade superior à dos controlos negativos correspondentes (estirpes WT e WT+pPICZαA), e os momentos que permitiram maior actividade enzimática para cada construção. Os melhores resultados foram obtidos para as isoformas C525 com o sinal de secreção nativo e C209 com o sinal de secreção α-factor, clonadas na estirpe GS115 (1,100U/mg de proteína às 24h e 0,233U/mg de proteína às 120h, respectivamente), e a isoforma C525 com o α-factor, clonada na estirpe KM71H (0,366U/mg de proteína às 139h). Destas três, a primeira foi a que expressou melhor e mais rapidamente a proteína. A análise de SDS-PAGE dos precipitados e dos secretomas respeitantes aos diferentes momentos não se revelou conclusiva, provavelmente devido à baixa concentração proteica das amostras. Propõe-se a produção em larga escala e purificação destas três proteínas recombinantes para caracterizar a sua actividade quitinolítica, para depois averiguar o seu potencial biofungicida contra fitopatogénios de macieira e pereira.This work focused on cloning and expressing three different genes encoding class III acidic chitinases from apple in Pichia pastoris heterologous expression system, using GS115 and KM71H strains. Three constructs were prepared with the genes C525, C209 e C203 and the α-factor secretion signal from S. cerevisiae, and two constructs with the genes C525 and C209 and the native secretion signal. The constructions were cloned in pPICZαA vector and introduced in the yeast. We obtained positive clones for all constructs, except for construct C209 with the native secretion signal, and a Southern analysis suggested the presence of only one copy of the construct in each recombinant. After inducing the expression with methanol, cultures‟ growth and total protein amount, at different moments, were evaluated, and the chitinolytic activity of the cell-free‟s medium was determined, using glycolchitin as substrate. The constructs that showed, at least in one strain, higher activity than the corresponding negative controls (WT strain and WT+pPICZαA) were chosen, as well as the moments with better enzymatic activity, for each construct. The best results derived from C525 gene with the native secretion signal and C209 gene with the α-factor signal, cloned in the GS115 strain (1,100U/mg protein at 24h and 0,233U/mg protein at 120h, respectively), and C525 gene with the α-factor signal cloned in the KM71H strain (0,366U/mg protein at 139h). Among these three, the first is the one that expressed the protein better and faster. A SDS-PAGE analysis of the pellets and supernatants from the different moments didn‟t show the expected results, probably due to the samples‟ low protein concentration. We propose to produce in large scale and purify these three recombinant proteins to characterize their chitinolytic activity and further analyze their potential as natural fungicide against phytopathogens that strongly affect apple and pear