Isolation, screening and characterization of microorganisms with potential for biofuels production

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Rapid global population growth has increased the demand for food and energy supply. The limited oil reserves, pollution concerns, global warming and political instability and disagreements, lead to an increased financial support for sustainable and environmental sources of energy, biofuels. In the last decades there is an increasing interest in the development of the bioethanol production from lignocellulosic residues, which do not compete directly with food. However, the low efficient conversion of cellulosic biomass to biofuels hinders its success. Alternative substrates are inulin containing plants, as Jerusalem artichoke, representing a renewable and inexpensive raw material for industry and biofuel production. In this work, the main goal was to search for new microorganisms, with high potential to produce bioethanol, due to the presence of better ethanologenic characteristics or ability to produce relevant hydrolytic enzymatic machinery. From the isolation and screening of 98 novel strains, 7 were selected and further characterized. A preliminary identification was performed using FISH. Three isolates which showed inulinase capacity gave a putative identification as Z. bailii strains, and the best (Talf1) was optimized and characterized for inulinase production. Talf1 enzymatic extract presented maximum activity (8.7 U/ml) at 45 ºC and pH 5.5, and high stability at 30ºC. Talf1 isolate was used in a Consolidated Bioprocessing (CBP) and its enzymatic extract in a Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) process, for bioethanol production, obtaining an ethanol yield of 45% and 47% from pure inulin; and a yield of 51% and 48% from Jerusalem artichoke juice, respectively. Four selected isolates from strawberry tree fruit (STF) were used in a fermentation assay using STF juice, producing 86 - 100 g/l of ethanol from this raw material, at a very high yield (47-50%). These results show the enormous potential of inulin and Jerusalem artichoke as substrates for bioethanol production and the application of these novel yeasts as ethanol and/or inulinase producers.A exploração de novos recursos energéticos foi crucial para a revolução tecnológica que ocorreu no início do século 19. Já nesse século se conhecia o enorme potencial do álcool como fonte de energia, visto que o primeiro protótipo de motor de ignição foi desenhado para funcionar com este combustível. No início do século 20, a produção de etanol foi substituída pela gasolina, devido ao baixo custo de extração. Os combustíveis fósseis têm sido, desde então, a principal fonte de energia utilizada. O rápido aumento da população tem intensificado a necessidade do aumento de produção alimentar e energética. As limitadas reservas de petróleo, preocupações ambientais, o aquecimento global e a instabilidade política renovaram o interesse e, consequentemente, o apoio financeiro direcionada para o desenvolvimento de fontes renováveis de energia, como os biocombustíveis. Vários tipos de biocombustíveis têm sido estudados, mas apenas dois são produzidos à escala industrial: o biodiesel e o bioetanol. O bioetanol apresenta as melhores qualidades para a sua utilização nos atuais motores, podendo ser utilizado como aditivo na gasolina, sendo por isso, o biocombustível mais utilizado a nível mundial (Antoni et al., 2007). A produção mundial de bioetanol à escala industrial utiliza principalmente duas fontes naturais: Saccharum officinarum (cana-de-açúcar) e Zea mays L. (milho). A cana-de-açúcar é sobretudo utilizada no Brasil, sendo o segundo maior produtor mundial de bioetanol, enquanto o milho é a principal fonte natural utilizada nos E.U.A., o maior produtor mundial. Estes dois países representam 88% da produção global (REN21). Na produção de bioetanol ocorre a fermentação alcoólica dos substratos naturais, diretamente a partir da cana-de-açúcar (que contém principalmente sacarose); para a bioconversão do milho (composto principalmente por amido) há necessidade de um passo prévio de hidrólise enzimática para a sua conversão em açúcares simples. O bioetanol obtido a partir de culturas agrícolas produzidas exclusivamente para esse fim, ocupando assim área cultivável, denomina-se Bioetanol de 1ª Geração (1G). Este tipo de produção levanta questões morais e éticas porque, deste modo, o bioetanol compete diretamente com a produção alimentar (Luo et al., 2009). Para ultrapassar este problema, tem sido proposto a utilização de resíduos lenhocelulósicos, como substratos, para produção de Bioetanol de 2ª Geração (2G). Este bioetanol não compete diretamente com a produção alimentar, apesar de consumir recursos agroindustriais. Atualmente a conversão de biomassa lenhocelulósica em bioetanol é ainda um procedimento caro e de baixa eficiência, sendo economicamente desfavorável a sua aplicação (Gibbons and Hughes, 2009). O principal obstáculo é o custo do pré-tratamento para conversão dos vários polímeros (celulose, hemicelulose, xilano, etc.) em açucares simples (glucose e xilose principalmente) que esta biomassa necessita, quer seja por degradação enzimática (com custos associados de produção de extratos enzimáticos); quer seja a aplicação de métodos químicos, como hidrólise ácida (que para além do seu custo, leva à produção de composto inibidores do crescimento microbiano). Existem vários bioprocessos propostos para a produção em larga escala de 2G nomeadamente a hidrólise separada da fermentação (SHF), em que o passo de hidrólise da biomassa lenhocelulósica antecede a fase de produção de bioetanol; a fermentação e sacarificação simultâneas (SSF), neste caso há a adição exógena de enzimas ou a co-fermentação de biomassa com um microrganismo produtor das enzimas necessárias à conversão dos polímeros nos seus monómeros, disponibilizando assim os açúcares simples para o microrganismo etanologénico os converter em etanol; e o bioprocesso consolidado (CBP), em que a produção de enzimas para a hidrólise enzimática e a produção de etanol ocorrem por ação do mesmo microrganismo (considerado o melhor processo conceptual) (Lynd, 1996). Infelizmente não está descrito nenhum microrganismo que, simultaneamente, seja capaz de produzir a maquinaria enzimática necessária para a hidrólise da biomassa lenhocelulósica e que a produção de etanol atinja valores de rendimento e produtividade economicamente viáveis. Dadas as dificuldades de implementação à escala industrial do 2G e movidos por preocupações ambientais, de utilização de solos cultiváveis e o desequilíbrio atual no ciclo de carbono, levou alguns cientistas a desenvolver o Bioetanol de 3ª Geração (3G). Este bioetanol recorre a microalgas com elevado conteúdo nutritivo para a sua produção. Ao invés de aproveitar resíduos agroindustriais como substrato, as algas são produzidas explorando os recursos hídricos para a produção de biomassa. Desta forma, não há competição com produção alimentar nem área cultivável e não há utilização de recursos agroindustriais. No entanto, o baixo rendimento de produção de biomassa torna este processo, ainda, economicamente inviável à escala industrial (Goh and Lee, 2010). Uma alternativa a estas opções é a utilização de plantas produtoras de inulina, como Helianthus tuberosus (tupinambo), que representam um recurso renovável, barato e abundante para a produção de bioetanol. O tupinambo tem várias características importantes que justificam a sua utilização, nomeadamente a tolerância a frio, à seca, ao vento e a terrenos arenosos e/ou salinos, com uma alta taxa de fertilidade e de resistência a pestes e doenças, não necessitando obrigatoriamente de terrenos férteis para se desenvolver. Estas características tornam-no numa fonte apetecível de biomassa para conversão em bioetanol que não compete pelos terrenos cultiváveis utilizados para produção alimentar (Neagu and Bahrim, 2011; Chi et al., 2011; Bajpai and Margaritis, 1982). Este trabalho teve como objetivo a procura de novos microrganismos, especialmente leveduras, a partir de isolamentos de diferentes fontes naturais, nomeadamente dos frutos de alfarrobeira (Ceratonia síliqua), ameixeira (Prunus domestica), cerejeira (Prunus avium), figueira (Ficus carica), medronheiro (Arbutus unedo) e pessegueiro (Prunus persica) e tubérculos de tupinambo (Helianthus tuberosus). Os microrganismos foram selecionados com base nas suas características etanologénicas (maior tolerância a elevadas concentrações de etanol, pH e temperatura e, por isso, capazes de fermentações alcoólicas mais longas); e/ou na capacidade de produção de enzimas relevantes, como inulinases, para posterior aplicação em bioprocessos industriais. A partir de 98 isolados, dos quais 90 eram leveduras e 8 bactérias, foram selecionados 7 isolados diferentes. Destes, 3 isolados foram selecionados porque apresentaram capacidade de converter inulina purificada em etanol; os outros 4 isolados foram selecionados porque foram capazes de produzir etanol mais rapidamente, utilizando sumo de medronho como meio completo. Às 7 estirpes foi aplicado um procedimento de identificação preliminar, utilizando sondas marcadas com um fluoróforo, para hibridação de fluorescência in situ (FISH), especificas para várias espécies de leveduras vínicas, nomeadamente: Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii e Zygosaccharomyces bailii. As 7 estirpes apresentaram um resultado positivo para apenas uma destas sondas, distribuindo-se por três espécies diferentes: Lachancea thermotolerans (AP1), Saccharomyces cerevisiae (DP2 e GluP4) e Zygosaccharomyces bailii (GerP3, Calf2, Talf1 e Talf2). Foi realizado um controlo positivo em cada experiencia de FISH para cada sonda testada, utilizaram-se estirpes identificadas e existentes no laboratório, nomeadamente: CBS 314 (Hanseniaspora uvarum), Kluyveromyces marxianus 516F, CBS 2803 (Lachancea thermotolerans), NRRL Y-987 (Metschnikowia pulcherrima), Saccharomyces cerevisiae CCMI 885, PYCC 4478 (Torulaspora delbrueckii) e Zygosaccharomyces bailii 518F. Foi também utilizada uma sonda universal para células eucariotas (EUK516) em todas as células utilizadas, como controlo positivo, de forma a assegurar a presença de RNA acessível nas células após o procedimento de fixação, essencial na técnica de FISH. Esta identificação preliminar deverá ser validada com técnicas moleculares mais precisas, complementadas com estudos completos de morfologia e fisiologia. Das estirpes preliminarmente identificadas como Z. bailii, três (Calf2, Talf1 e Talf2) apresentaram capacidade de produção de inulinases, uma caraterística não referenciada em estirpes desta espécie (Kurtzman et al., 2011). Foi traçado um perfil metabólico das estirpes, Calf2, Talf1 e Talf2, em confronto com a estirpe Z. bailii 518F utilizando duas galerias API distintas: API ZYM and the API 20C AUX. Conclui-se que as três estirpes têm perfiz metabólicos semelhantes entre si e com Z. bailii 518F, revelando características fisiológicas importantes para aplicação futura. A produção de inulinases é uma característica essencial para a fermentação de inulina em etanol, permitindo a utilização de matérias-primas ricas em inulina como substrato para produção de bioetanol. Com esta finalidade, foi avaliada a produção de inulinases extracelulares das 3 estirpes, utilizando dois substratos indutores: a inulina (extraída de chicória) e o sumo de tupinambo. A estirpe Talf1 apresentou maior atividade enzimática extracelular quando induzida com sumo de tupinambo (8,7 U/ml) do que a estirpe Calf2 e Talf2, que atingiram 4,1 e 7,8 U/ml respetivamente. Utilizando inulina purificada como substrato indutor, todas as estirpes atingiram aproximadamente 0,6 U/ml de atividade enzimática no extrato celular, o que demonstra a fraca capacidade de indução por parte da inulina purificada. De forma a otimizar a produção de inulinases, utilizando a estirpe Talf1, foram testados outros substratos como indutores de inulinases: duas inulinas comerciais, extraídas de fontes naturais diferentes; e três matérias-primas: raízes de acelga, tubérculos de dália e o resíduo sólido de tupinambo, obtido após extração do sumo. Conclui-se que as inulinas comerciais purificadas são fracos indutores, não atingindo valores superiores a 0,6 U/ml, enquanto todas as matérias-primas naturais induziram positivamente a produção de inulinases, obtendo 1,9 U/ml com raízes de acelga, 1,5 U/ml com tubérculos de dália e 5,9 com o resíduo sólido de tupinambo. Concluiu-se que o tupinambo, em particular o sumo, é o melhor substrato indutor, para a produção de inulinases extracelulares utilizando a estirpe Talf1. Foi feita a caracterização bioquímica do extrato enzimático desta estirpe, revelando que a temperatura e o pH ótimos de atividade são 45ºC e 5,5 respetivamente. Foi determinada a estabilidade à temperatura e ao pH; o extrato enzimático manteve 57% da sua atividade inicial ao fim de 24 dias, quando mantido a 30ºC e ao pH natural (5,5). No entanto alterações de pH diminuem drasticamente a estabilidade do extrato (a 30 ºC). As características do extrato enzimático da estirpe Talf1 são promissoras para a sua posterior utilização em bioprocessos que utilizem inulina ou fontes ricas em inulina como substrato desde que ocorram a pH ácido (aproximadamente 5,5) e à temperatura de 30ºC. Dadas as características descritas, a estirpe Talf1 foi utilizada num bioprocesso consolidado (CBP) e o respetivo extrato enzimático utilizado num processo de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF) para produção de bioetanol. Para o processo SSF foi utilizada a estirpe etanologénica S. cerevisiae CCMI 885 e o meio foi suplementado com o extrato enzimático produzido por Talf1. Na utilização de inulina como única fonte de carbono, o processo SSF apresentou maior rendimento e produtividade máximos de etanol (47% e 2,75 g.l-1.h-1) e obteve-se maior concentração de etanol no meio (78 g/l), enquanto no processo CBP produziram-se 67 g/l de etanol, com um rendimento e produtividade máximos de 45% e 1,70 g.l-1.h-1 respetivamente. Foi realizado, em paralelo, um crescimento controlo com S. cerevisiae CCMI 885 e inulina como única fonte de carbono. Nestas condições, foram produzidas apenas 50 g/l de etanol, o que demonstra que a adição do extrato enzimático levou à hidrólise de polímeros de inulina que não são utilizados naturalmente por S. cerevisiae, apesar desta estirpe conseguir produzir enzimas que degradam parcialmente polímeros de inulina. A produção de bioetanol a partir diretamente de sumo de tupinambo foi testada pelos dois bioprocessos (SSF e CBP). Neste caso obtiveram-se melhores resultados utilizando a levedura Talf1 no bioprocesso consolidado. A estirpe Talf1 atingiu melhor produtividade (3,62 g.l-1.h-1,), rendimento (51%) e concentração máximas de etanol (67 g/l), do que a estirpe S. cerevisiae CCMI 885 em sumo de tupinambo (SSF), suplementado com o extrato enzimático contendo inulinases, que produziu 62 g/l de etanol, com um rendimento e produtividade máximos de 48% e 2,40 g.l-1.h-1, respetivamente. No ensaio controlo, utilizando a levedura S. cerevisiae CCMI 885 sem adição de qualquer enzima, obtiveram-se menores resultados de rendimento e produtividade máxima (42% e 2,07 g.l-1.h-1) e apenas 55 g/l de etanol produzido, um valor inferior aos resultados obtidos com os anteriores bioprocessos. Estes resultados são consistentes com os obtidos apenas com inulina como fonte de carbono, reforçando a hipótese de que esta estirpe, S. cerevisiae CCMI 885, seja capaz de hidrolisar algumas cadeias de inulina, mas não utilizar todos os açúcares presentes no sumo de tupinambo. Estes resultados mostram o potencial da inulina e fontes naturais ricas em inulina, como o tupinambo, para fontes alternativas na produção de bioetanol. No entanto para a aplicação industrial das estirpes descritas neste trabalho, será necessária posterior otimização de todo o processo. As 4 leveduras selecionadas a partir do rastreio inicial de fermentação de sumo de medronho (L. thermotolerans AP1, S. cerevisiae DP2, S. cerevisiae GluP4 e Z. bailii GerP3), foram utilizadas num ensaio de fermentação de sumo de medronho, em comparação com S. cerevisiae CCMI 885. O melhor resultado foi obtido com a estirpe S. cerevisiae CCMI 885, atingindo-se 108 g/l de etanol, com um rendimento máximo de 51%, igual ao teórico possível, e uma produtividade máxima de 1,29 g.l-1.h-1. No entanto, a estirpe de Z. bailii GerP3, com valores máximos de etanol, produtividade e rendimento máximos de 100 g/l, 1,11 g.l-1.h-1 e 50%, respetivamente, são próximos daqueles obtidos com a levedura S. cerevisiae. A estirpe Z. bailii GerP3 obteve, por isso, os resultados mais promissores para a aplicação num sistema de fermentação em estado sólido diretamente a partir de medronho. O desenvolvimento de um processo eficiente e economicamente viável para produção de bioetanol é crucial para a sociedade atual, servindo como alternativa à utilização de combustíveis fósseis, para uma população mundial que requer cada vez mais energia. A utilização de fontes naturais como o tupinambo e o medronho, para a produção de bioetanol, pode ajudar a reduzir a dependência energética dos combustíveis fósseis. No entanto, para produzir industrialmente bioetanol a partir destas fontes naturais renováveis, e ainda necessária a otimização do processo a escala industrial