Genetic programs associated with distinct levels of T-cell activation

Tese de mestrado. Biologia Molecular e Genética. Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências. 2010Versão públicaThe immune defense by CD8+ cytotoxic T-lymphocytes requires the priming of naïve T-cells, followed by clonal expansion and development of effector functions. It has been demonstrated in murine models that the quality (stimulation by immature vs mature DC) or the quantity (stimulation by an APC line for 4h or 20h) of the T cell stimulation signal give rise to effector T cells or partially activated T-cells. This latest population arise as a consequence of sub-optimal stimulation and are not deleted or tolerized. Instead these partially activated T cells are poised, in that they are programmed to survive in vivo over prolonged times and to become mobilized into a full-blown effector response capable of exerting therapeutic efficacy in tumor-bearing mice. Therefore, patients incapable of clearing tumors does not necessarily constitute a lost case, in that these 'poised' CD8+ T cells may be available for full activation. Microarrays were performed on OT-1 T cells stimulated for 0h, 4h or 20h and a histone demethylase and a transcription factor were considered in this study since they might play a functional role in the control of gene expression. Here we demonstrate that the mRNA levels of the genes decrease during the priming phase in OT-1 and TCRln5 T cells. Furthermore, the TCRln5 T cells showed a slower kinetic of cell division, confirmed by the slower acquisition of activation markers. Also, we demonstrated that the histone demethylase seem to be responsible for T cell proliferation independently of antigen, when overexpressed in unstimulated OT-1 T cells.As células dendriticas presentes nos tecidos apresentam um fenótipo imaturo, sendo incapazes de activar células T virgens. No entanto, a resposta a certos sinais estimulatórios induz a maturação das iDCs, tornando-se eficientes células apresentadoras de antigénio. A resposta imunitária mediada por linfócitos T CD8+ encontra-se dependente do priming de células T virgens, seguida de uma expansão clonal e desenvolvimento de uma função efectora e de memória imunológica. A activação de células T está dependente da formação da sinapse imunológica entre células T e APC, onde o despoletar do TCR pela ligação ao complexo antigénio-MHC inicia uma cascata de sinalização de sinal que resulta na entrada no ciclo celular. Foram desenvolvidas diversas condições laboratoriais que permitem o controlo sobre a qualidade da estimulação recebida pelas células T (estimulação através de DC imaturas e maturas) ou diferenças na duração do sinal (4h ou 20h) que resulta em dois níveis distintos de activação de linfócitos T CD8+. Verificou-se que uma óptima estimulação (estimulação através de DC maturas ou através de um contacto prolongado de 20h entre células T e APC) resulta no desenvolvimento de uma resposta efectora, acompanhada de uma expansão clonal, erradicação de células tumorais e formação de memória imunológica. No entanto, uma estimulação ineficiente (estimulação através de DC imaturas ou através de um curto contacto de 4h entre células T e APC) resulta num estado de activação de células T CD8+ onde há perda de expansão clonal e de uma resposta efectora funcional, impedindo a erradicação de células tumorais. Estas células parcialmente activadas não sofrem deleção clonal ou tolerância e são designadas células T ´poised‟. Esta população é de especial interesse devido ao seu potencial terapêutico visto que são capazes de reconhecer o antigénio e de desenvolver uma apropriada expansão clonal após um segundo encontro com o antigénio. Considerando que o estímulo recebido pela célula T ocorre antes da divisão celular, as diferenças na proliferação celular observadas deverão resultar de um programa intrínseco iniciado durante o priming da célula T. Consequentemente, as células T poised identificadas nos modelos in vivo (utilizando DC maturas e imaturas) e in vitro (contacto com APC por períodos de 4h ou 20h) deverão resultar de um mesmo programa genético associado a uma ineficiente activação das células T. De modo a identificar um mecanismo molecular responsável pelo fenótipo observado foram efectuados microarrays em células T estimuladas in vitro durante 4h e 20h, levando à identificação de dois genes candidatos. Verificou-se que a expressão de uma histona demetilase e de um factor de transcrição se encontra reprimida durante a fase de priming. Contudo, os resultados obtidos através do microarray não explicam o mecanismo molecular subjacente nem se o mesmo mecanismo se encontra presente nas células T dos modelos in vivo e in vitro. Assim, o objectivo deste estudo é tentar estabelecer uma ligação a nível molecular entre os dois tipos de células poised transgénicas através da sua caracterização no sistema in vitro de activação, avaliação funcional dos dois genes candidatos e quantificação dos níveis de mRNA. O modelo de activação in vitro permite o controlo da duração da estimulação das células T e, consequentemente, da quantidade de sinal recebido pelos linfócitos T durante o priming. Neste modelo, a linha celular SAMBOK funciona como célula apresentadora de antigénio e consiste numa linha celular de fibroblastos aderentes que expressam à superfície os epitopos reconhecidos pelos dois tipos de linfócitos T transgénicos, bem como moléculas responsáveis pela costimulação (CD80). A importância, a nível funcional, dos dois genes candidatos foi investigada através da transdução lentiviral dos linfócitos T. Deste modo, o efeito da expressão ectópica dos genes de interesse pode ser analisada, bem como o efeito da inibição da função do gene através de silenciamento por RNA de interferência (shRNA). Antes da sua transferência para ratinhos receptores, as células T transduzidas foram estimuladas in vitro durante 4h ou 20h na presença de SAMBOK. A análise funcional dos genes candidatos compreende a avaliação da proliferação celular e de marcadores de activação como CD69 e CD25. Neste estudo demonstrámos que os níveis de mRNA da histona demetilase e do factor de transcrição diminuem durante a fase de priming em ambos os linfócitos T transgénicos. Estes dois sistemas transgénicos apresentam perfis de proliferação idênticos quando estimulados durante 4h e 20h. No entanto, os linfócitos TCRln5 apresentam uma cinética de divisão celular menos rápida do que os linfócitos OT-1, confirmado pela aquisição tardia de marcadores de activação. A histona demetilase parece ser responsável pela proliferação de células T independente de antigénio, quando sobreexpressa em linfócitos OT-1 não estimulados. Após a transferência in vivo os níveis desta histona demetilase sobem. Deste modo, um estado de proliferação é observado em células T poised, quando estimuladas por apenas 4h, onde uma activação completa está ausente. Apesar de os mecanismos moleculares responsáveis pelaactivação de linfócitos T não serem totalmete conhecidos, futuros estudos serão importantes para desvendar a importância desta demetilase de histona no desenvolvimento de células T poised ou efectoras