Host response mechanisms to malaria infection: the role of cullin-ring ligases during plasmodium infection

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012A malária é uma das doenças infecciosas com maior taxa de prevalência em todo o mundo estimando-se nos últimos relatórios que em 2010 3,3 mil milhões de pessoas estariam em risco de contrair a doença. A África subsaariana é a região com maior risco onde se registam 81% da totalidade dos casos e 91% das mortes causadas por malária, sendo crianças com menos de cinco anos e mulheres grávidas as classes mais afetadas. Esta doença é causada por um parasita intracelular do género Plasmodium, sendo a espécie mais perigosa para o Homem o Plasmodium falciparum (P. falciparum). Outras espécies como P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi também afetam hospedeiros humanos. Por outro lado, P. berghei e P. yoelii são espécies que têm como hospedeiro os roedores e que são vulgarmente usadas como modelos para o estudo da malária por apresentarem características biológicas e fisiológicas similares aos parasitas que infectam humanos e primatas. O ciclo de vida do parasita Plasmodium compreende etapas obrigatórias em dois hospedeiros, um mosquito e um hospedeiro mamífero. A transmissão da malária realiza-se através da picada de um mosquito do género Anopheles infectado por Plasmodium, mas os sintomas advêm apenas da fase eritrocítica da infecção onde o parasita desencadeia ciclos de replicação assexuada no interior de eritrócitos. A etapa que precede esta fase é assintomática mas de grande importância para o estabelecimento da infecção. A fase pré-eritrocítica ocorre no fígado onde a forma do parasita transmitida pelo mosquito, o esporozoíto, invade um hepatócito dentro do qual se irá desenvolver e replicar para originar milhares de merozoítos que quando libertados para a corrente sanguínea têm a capacidade de invadir eritrócitos. Uma característica interessante dos esporozoítos é a sua capacidade de locomoção em movimentos espirais que resultam em trilhos de proteínas deixadas pelo parasita. Esta motilidade é essencial para o processo de migração do parasita desde o local da picada do mosquito, onde é depositado na pele, até ao fígado. Uma das proteínas que constituem estes trilhos é uma proteína de superfície denominada circumsporozoite protein (CSP). A identificação desta proteína como imunodominante na proteção induzida por esporozoítos atenuados por radiação, juntamente com a observação de que os complexos MHC classe-I têm a capacidade de apresentar antigénios da CSP induzindo a activação de células T CD8+ e assim protegendo contra esporozoítos vivos, levou a que esta proteína tenha suscitado um interesse crescente por parte da comunidade científica. Vários projectos de investigação têm sido direcionados para a utilização desta proteína para tentar induzir imunidade e desenvolver novas vacinas contra amalária. Foi ainda descrito que a apresentação dos antigénios da CSP pelo complexo MHC classe-I é dependente do processamento prévio da proteína no proteossoma. Para que este processamento aconteça é necessário que a proteína seja reconhecida e direcionada para o proteossoma. Este mecanismo depende da associação de moléculas de ubiquitina à proteína alvo num processo denominado ubiquitinação e cujo elevado grau de especificidade e regulação é da responsabilidade das enzimas E3-ligases. As Cullin-RING ligases (CRL) constituem a maior classe conhecida de E3s. Estes complexos proteicos são constituídos por uma proteína conservada de ligação à ubiquitina e uma proteína estrutural (Cullin) e respectivo adaptador. Estas últimas são variáveis e conferem especificidade de ligação ao substrato. Dados de análise genómica e proteómica revelaram que a expressão de três de seis complexos CRL (Cullin1, Cullin2, Cullin4A e respectivos adaptadores) está diminuída em células infectadas por Plasmodium. Deste modo, propôs-se como primeiro objectivo deste trabalho investigar o envolvimento das CRL na ubiquitinação da CSP, colocando como hipótese que complexos formados por diferentes Cullins poderão intervir de forma diferente na ubiquitinação da CSP. Estes resultados poderão ainda trazer novos indícios à hipótese de que o parasita é capaz de modular o sistema ubiquitina-proteossoma do seu hospedeiro como estratégia de evasão ao sistema imunitário. Para isso planeou-se um ensaio de pull down sobre-expressando a CSP de P. yoelii, ubiquitina e as várias Cullins (CUL), prosseguindo com um western blot de modo a comparar os perfis de poli-ubiquitinação da CSP obtidos com as várias Cullins. Deste ensaio, demonstrou-se que a afinidade para a ubiquitinação da CSP parecia vir principalmente da CUL1 e da CUL4B. No perfil da CUL1 é também notória a presença de um maior número de bandas com elevado peso molecular que advêm da adição consecutiva das moléculas de ubiquitina que levam à acumulação sucessiva de 8,5kDa ao peso molecular da CSP. De modo a confirmar a implicação da CUL1 na ubiquitinação da CSP, um vector com a forma dominante negativa da CUL1 (dnCUL1) foi sobre-expresso em paralelo à CUL1 num ensaio de pull down. Esta proteína mutada possui a capacidade de se ligar ao complexo mas não de o activar inibindo competitivamente a ubiquitinação da CSP pelo CRL formado pela CUL1. Os resultados desta experiência indicam que a CUL1 parece ser capaz de promover a poli-ubiquitinação da CSP em maior extensão do que dnCUL1. Apesar dos resultados serem apenas preliminares parecem trazer bons indícios do envolvimento da CUL1 na ubiquitinação da CSP. Deste modo, juntamente com os resultados da proteómica que demonstravam que a CUL1 era uma das Cullins que apareciam com expressão diminuída em células infectadas por Plasmodium, os resultados parecem apoiar a hipótese de que o parasita modula o sistema ubiquitinaproteossoma do seu hospedeiro. No entanto, será necessário continuar os estudos nesta direcção de forma a ser possível obter mais indícios que confirmem esta hipótese. No presente trabalho pretendíamos ainda avaliar a relevância que as CRL teriam para o Plasmodium, visto que foi descrito que os parasitas possuem todos os componentes necessários à ubiquitinação, com destaque para CRL funcionais. Sabe-se ainda que as CRL também dependem da activação por nedilação, tendo já sido identificados vários homólogos de proteínas como Nedd8 e a CUL1, entre outras. Evidências sugerem que este sistema de ubiquitinação deverá desempenhar um papel importante no desenvolvimento do parasita embora pouco se saiba ainda sobre esta matéria. Deste modo, propomos investigar se as CRL terão uma função importante para o desenvolvimento do parasita no estabelecimento da infecção. Para tal, usou-se um composto capaz de inibir especificamente a activação da CRL interferindo com o seu processo de nedilação, o MLN4924. Numa primeira abordagem, tentámos avaliar as repercussões do uso deste composto na fase pré-eritrocítica da infecção usando para isso uma estratégia baseada em luminescência para quantificar os níveis de infecção. Destes resultados concluímos que as concentrações de droga usadas aparentemente não causam efeito na infecção de Plasmodium, o que nos levou a testar também o efeito na fase eritrocítica da infecção. Para isso, testámos o efeito na infecção através de uma técnica de citometria fluxo que permite avaliar tanto os níveis de parasitémia como a maturação do parasita. Aparentemente, MLN4924 tem a capacidade de atrasar ou parar o desenvolvimento do parasita nesta fase da infecção apesar de ter que ser usado em concentrações elevadas na ordem do micro-molar. Estas observações revelam que as CRL serão de facto importantes para o desenvolvimento de Plasmodium constituindo ainda um alvo com elevada especificidade para o desenvolvimento de novos compostos antimaláricos. Este trabalho permitiu elucidar a elevada importância dos CRL e do sitema ubiquitinaproteossoma no contexto de uma infecção por Plasmodium, demonstrando-se relevantes tanto para o hospedeiro como para o parasita.Malaria is one of the most prevalent infectious diseases worldwide and is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium, which are obligatory intracellular parasites with a life cycle that requires both mosquito and mammalian hosts. In the mammalian host, the parasite undergoes a silent phase during hepatocyte invasion that seems to be carried out without being detected by the host immune system. One of the proteins described as immunodominant in this stage is the circumsporozoite protein (CSP), that is involved in protection induced by immunization with irradiated sporozoites and can be presented as antigen by MHC class-I complexes being able to activate CD8+ T cells protecting against a live sporozoite challenge. Previous genomic and proteomic studies revealed that Cullin-RING ligases (CRL), specific recognition factors in the ubiquitin-proteasome system, are down-modulated in infected cells. Now we hypothesize that the CRLs may be involved in the ubiquitination of CSP and we will assess this through pull down experiments evaluating CSP ubiquitination in the presence of the different CRL backbones, the Cullins (CUL). The results showed different CSP polyubiquitination patterns in particular using CUL1 and CUL4B. Further experiments using a dominant negative form of CUL1 (dnCUL1) seem to indicate that CUL1 is indeed promoting CSP poly-ubiquitination. Together with the proteomic data, these observations support the hypothesis of the modulation of the host UPS in infected cells as a Plasmodium immune-evasion strategy. The CRL relevance for Plasmodium development and infection activity was also investigated using a specific neddylation inhibitor - MLN4924. Evidences show that CRLs is important during Plasmodium blood stages, as MLN4924 could actively delay or arrest the parasite development. Although this compound is not potent enough to be used as antimalarial, it evidenced that CRL could represent a new specific target to try to develop new antimalarial compounds