A differential polypeptide approach to fight human fungal pathogens

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Os fungos patogénicos representam, à escala mundial, uma séria ameaça para a saúde humana, verificando-se, nas últimas duas décadas, um aumento significativo de infecções fúngicas graves devido a fungos patogénicos oportunistas. Apesar das notáveis melhorias que se têm verificado na descoberta de novos agentes antifúngicos nos últimos 10 anos, o diagnóstico de infecções fúngicas é ainda um problema devido à limitada disponibilidade de agentes antifúngicos e, consequentemente, as infecções fúngicas tornaram-se num importante factor de mortalidade e morbilidade e cada vez mais representam um fardo no sistema de saúde. O aumento acentuado de fungos patogénicos menos comuns mas clinicamente importantes é uma consequência directa do aumento do número de pacientes que possuem um sistema imunitário deficiente, que por sua vez é uma consequência do aumento do número de casos de SIDA e dos avanços na tecnologia terapêutica. No entanto, enquanto que no passado as micoses oportunistas ocorriam tipicamente em hospedeiros imunocomprometidos, estas complicações são cada vez mais observadas em pacientes adultos doentes, cirúrgicos mas não-imunocomprometidos. As leveduras são um dos grupos de microrganismos causadores de infecções fúngicas humanas, sendo a candidemia uma das principais causas de infecções nosocomiais. As espécies de Candida são leveduras comensais de humanos que causam infecções tanto superficiais como invasivas. Estes organismos ocorrem abundantemente no tracto gastrointestinal humano e na vagina, podendo ser isoladas a partir de fezes e de mucosas onde existem como organismos comensais. Quando se tornam patogénicos podem provocar candidíase disseminada, uma síndrome que pode colocar a vida em risco com uma mortalidade atribuída de 10-50%. De acordo com ARTEMIS Global Antifungal Surveillance Program, C. albicans é a espécie de Candida mais comum (63-70%) em infecções fúngicas invasivas, seguida de C. glabrata (44%), C. tropicalis (6%) e C. parapsilosis (5%). Relativamente às opções de tratamento, o agente antifúngico ideal deve possuir um largo espectro de acção, baixos níveis de resistência, vias de administração flexíveis, causar poucos efeitos secundários e ter interacções limitadas com outras drogas. Actualmente existem quatro grupos de antifúngicos disponíveis para o tratamento de micoses sistémicas em humanos, os polienos, azóis, equinocandidas e a flucitosina. Nenhuma destas classes de antifúngicos possui todas as características anteriormente descritas o que em última análise conduz a falhas no tratamento. Dada a substancial mortalidade e morbilidade associadas com infecções fúngicas invasivas, o tratamento utilizando uma combinação de agentes antifúngicos é muitas vezes considerado. É também essencial identificar novos e potentes agentes antifúngicos, com novos modos de acção, de modo a combater o actual aumento de infecções fúngicas. Foi desenvolvida uma pesquisa no Instituto Superior de Agronomia que culminou na descoberta de uma abordagem nova e original na luta contra os fungos patogénicos. Esta abordagem refere-se a um polipéptido singular, denominado BLAD (Banda de Lupinus Albus Doce, num gel de electroforese), que possui uma forte actividade inibitória na germinação e desenvolvimento de esporos de fungos patogénicos. A BLAD apresenta uma actividade antifúngica tanto preventiva como curativa, é activa contra uma ampla gama de fungos patogénicos ao mesmo tempo e o desenvolvimento de resistência por parte dos fungos é improvável. Apesar de todos os resultados animadores obtidos até à data, pouco se sabe acerca do mecanismo de acção da BLAD, existindo apenas algumas evidências de que actua ao nível do envelope celular (membrana plasmática e parede celular). Este plano de trabalho está inserido num projecto mais amplo cujo objectivo é determinar se a BLAD é eficaz no tratamento de infecções fúngicas humanas. Para tal, e tendo em conta que o objectivo final é aplicar a BLAD na área clínica, o primeiro passo passou por produzir este polipéptido através da sua expressão heteróloga, sob a forma recombinante. Actualmente existem inúmeros hospedeiros novos e sofisticados mas, considerando a ausência de resíduos glicosídicos no polipéptido BLAD e as muitas vantagens que o sistema de expressão usado pela Escherichia coli apresenta, este foi o microrganismo escolhido como célula hospedeira. O gene que codifica para o polipéptido BLAD já se encontrava inserido no plasmídeo pET 151 D-TOPO® e, portanto, o primeiro passo passou por clonar o plasmídeo em One Shot® TOP10 Chemically Competent E.coli, para confirmar a correcta inserção do inserto, e em BL21 Star™(DE3) One Shot® Chemically Competent E. coli para a expressão do produto. Fizeram-se vários ensaios de expressão de modo a perceber o tempo óptimo de indução necessário para a obtenção de uma maior expressão do produto, o que permitiu concluir que o maior rendimento era atingido ao fim de 6 horas de indução com IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). De seguida procedeu-se à purificação da BLAD recombinante com recurso a colunas de Ni-NTA e Dialysis step-wise. Uma vez purificada a BLAD recombinante, realizaram-se diferentes Immuno blots para confirmar que se tratava de facto do polipéptido BLAD, com recurso a um anticorpo específico para o mesmo, e para verificar se este mantinha actividade de lectina (pela sua capacidade de reconhecer anticorpos inespecíficos), propriedade característica da BLAD. Para tal utilizou-se como anticorpo primário um anticorpo inespecífico. A presença de sinal em ambos os Immuno blots revelou que não só se tratava de facto da BLAD como esta mantinha a actividade de lectina. Por último testou-se a actividade antifúngica da BLAD recombinante em C. albicans. Os resultados obtidos demonstraram que esta possui forte actividade antifúngica visto que é necessária, para igualdade de outros factores, uma menor concentração para provocar o mesmo grau de inibição e morte do microrganismo que a BLAD purificada do tremoço. Apesar de se ter revelado um sistema de expressão bastante promissor e se terem obtidos excelentes resultados com a BLAD recombinante, não foi possível obter quantidade de proteína suficiente para o restante trabalho, pelo que o trabalho foi continuado com recurso à BLAD purificada do tremoço. De seguida, foram avaliados os efeitos morfológicos e fisiológicos da BLAD, usando C. albicans como modelo de fungos patogénicos unicelulares. Começou por se determinar a Concentração Mínima Inibitória (MIC) e Mínima Fungicida (MFC) de BLAD, em diferentes meios de cultura, com diferentes densidades de inóculo. Prosseguiu-se o trabalho apenas com o meio em que a BLAD revelou ser mais letal (meio PDB) e com a densidade de inóculo óptima para os ensaios seguintes (105 células/mL), condições onde são necessários 125 μg/mL de BLAD para inibir o crescimento do microrganismo e 250 μg/mL para provocar a sua morte. Uma vez optimizadas as condições de crescimento e as concentrações de BLAD, realizou-se uma curva de crescimento de C. albicans exposta às concentrações inibitória e letal de BLAD, de modo a estudar o seu efeito no crescimento da levedura. A curva obtida permitiu concluir que a adição de BLAD ao meio de cultura tem um forte efeito no crescimento de C. albicans visto que células expostas à concentração inibitória de BLAD apresentam uma diminuição na taxa de crescimento, quando comparado com a situação controlo, e as expostas à concentração letal tornam-se não viáveis ao fim de 4 horas de exposição. Em simultâneo foi avaliada a actividade metabólica e a integridade da parede celular de C. albicans, recolhendo amostras ao longo da curva de crescimento e visualizando-as num microscópio de fluorescência. Foram adicionados dois fluorocromos às amostras, FUN-1, indicador de actividade metabólica e, consequentemente, viabilidade, e Calcofluor white, marcador de parede celular. Os resultados obtidos sugerem que ao fim de 12 horas de incubação com a concentração letal de BLAD, as células tornam-se metabolicamente inactivas, não viáveis e não cultiváveis mas, no entanto, não se verificam alterações visíveis ao nível da integridade da parede celular de C. albicans. Por último determinou-se a localização celular da BLAD aquando da ocorrência de morte celular. Estudos anteriores realizados com Alexa Fluor® 488, composto fluorescente com elevada afinidade para o grupo amina das proteínas, demonstravam que a BLAD se situava no interior da célula. No entanto este método revelou-se inconclusivo e, como tal, recorreu-se à imunofluorescência que, numa primeira fase, revelou que a BLAD se liga ao envelope celular, sem destabilizar a parede celular, mas não entra para o interior da célula. Com o objectivo de esclarecer se a ligação da BLAD à célula se dava ao nível da membrana ou parede celular, realizou-se nova imunofluorescência com protoplastos de C. albicans, o que revelou que a BLAD se liga à membrana celular, sem vestígios da mesma no interior da célula. Por último, procurou-se os alvos específicos da BLAD no envelope celular dos agentes patogénicos, utilizando para isso, proteínas da membrana dos protoplastos de C. albicans. Começou por se analisar o perfil proteómico da membrana celular de C. albicans, após remoção da parede celular, através da formação de protoplastos. De seguida, e com o objectivo de identificar os resíduos glicosídicos alvo do polipéptido BLAD, a fracção proteíca da membrana celular de C. albicans foi sujeita a três processos de desglicosilação: remoção dos oligossacáridos N-ligados a proteínas, dos oligossacáridos O-ligados a proteínas e de ambos. O perfil electroforético obtido revelou que, tal como esperado, existe uma variação ao nível do peso molecular das proteínas, resultante da remoção dos resíduos glicosídicos. É de salientar que após remoção dos oligossacáridos O-ligados a proteínas o perfil das proteínas de membrana de C. albicans foi drasticamente alterado, resultando no desaparecimento das proteínas de maior peso molecular. Após incubação da BLAD com cada tipo de membrana celular sujeita a diferentes processos de desglicosilação, verificou-se que o polipéptido possui elevada afinidade para a membrana celular de C. albicans, o que está de acordo com os resultados obtidos na imunofluorescência, uma vez que permanece ligada mesmo após o tratamento para a remoção dos oligossacáridos N- e O-ligados a proteínas em simultâneo. No entanto, não foi possível determinar o alvo específico da BLAD na membrana celular de C. albicans uma vez que esta apresenta elevada afinidade para todos os tipos de proteínas desglicosiladas testadas presentes na membrana celular. Este resultado pode ter como explicação o facto de a BLAD poder ter mais que um alvo ou, mais provavelmente, que os métodos usados para a N- e O-desglicosilação não terem sido 100% eficazes para estas condições e, portanto, podem não ter removido na totalidade os oligossacáridos das glicoproteínas presentes na membrana celular de C. albicans.Pathogenic fungi represent, worldwide, a serious threat for human’s health, being Candida albicans the most common cause of invasive fungal infections. All antifungal agents available present many disadvantages and, therefore, it is essential to identify new potent and safe antifungal drugs with novel modes of action. BLAD is a novel polypeptide derived from Lupinus which exhibits a powerful inhibitory activity upon germination and development of spores from human fungal pathogens and a major goal is to use BLAD in the clinical area. With that in mind, the first objective was producing BLAD in a recombinant form, through its heterologous expression, using Escherichia coli as the host cell. The production and purification of recombinant BLAD was achieved, and it possess the same biological activities as its “Lupinus” form, such as a strong antifungal activity. The second goal was assessing the physiological and morphological effects of BLAD on fungi, using C. albicans as a unicellular pathogenic fungal model. Upon exposure of C. albicans to lethal concentration of BLAD, the yeast became metabolically inactive, non-viable and nonculturable. Moreover, the results obtained suggest that BLAD passes through the cell wall and binds to the plasma membrane, but it does not enter into the cell. Finally, the search for specific targets for BLAD in the pathogen cell envelope was assessed, using C. albicans membranes. Although having high affinity to all types of deglycosylated proteins from the cell membrane tested, the specific type of glycoprotein which is targeted by BLAD was not uncovered. This possibly means that BLAD has more than one target, and/or, more likely, the deglycosylation mehtods used in the present work did not fully remove either N-linked and/or O-linked oligosaccharides in these conditions from C. albicans cell membrane glycoproteins