Gene expression regulation of human hemojuvelin by two small open reading frames

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012The iron is an essential element for many biological reactions carried out by living systems. A tight regulation of the systemic iron homeostasis is crucial to avoid pathological conditions of iron deficiency or overload. Juvenile Hemochromatosis is an early-onset inherited disorder associated to an iron overload caused by mutations on the hepcidin gene or in the gene encoding hemojuvelin (HJV). HJV is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-linked membrane protein shown to be a co-receptor for a class of ligands called bone morphogenetic proteins (BMPs), which trigger a response to the iron increase by activating the hepcidin transcription. Thus, HJV is involved on iron homeostasis through regulation of hepcidin transcription levels. A better knowledge of the mechanisms implicated in HJV gene expression is crucial to understand its role in the iron homeostasis. The 5’ leader sequence of the human HJV mRNA has two upstream AUGs (uAUGs) that share the same codon stop, forming two upstream open reading frames (uORFs) with 28 and 19 codons. To evaluate the effect of these uORFs in the translational regulation of HJV, reporter constructs containing several HJV 5’ leader sequences fused to the firefly Luciferase cistron, were tested in HeLa and HepG2 cells. Luciferase activity was measured by luminometry assays and the corresponding mRNA levels, quantified by real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results revealed that the HJV uORFs decrease the translational efficiency of the main ORF in about 6-fold. Furthermore, we have observed that the uAUGs suffers low leaky scanning which contributes to the translational repression of the main ORF. Thus, translation reinitiation is the main mechanism involved in the production of HJV protein. Aiming to further characterize the mechanism through which the HJV uORFs affect downstream translation, we have observed that the uORF2 encoded peptide seems to cause ribosomal stalling, which also prevents translation of the downstream main ORF. Together, these results produce a framework for understanding how human HJV gene expression is fine-tuned controlled during translation.O ferro é um elemento essencial para muitas reacções biológicas envolvidas no funcionamento dos organismos. A regulação rigorosa da homeostase do ferro é crucial para evitar patologias relacionadas com a deficiência ou excesso de ferro no organismo. Nos casos em que a homeostase do ferro é perturbada podem ocorrer diversas patologias tais como a Hemocromatose Juvenil. Esta doença está associada ao excesso de ferro e é devida a mutações nos genes da hepcidina ou da hemojuvelina (HJV). A HJV é uma proteína de membrana com um domínio glicosilfosfatidilinositol (GPI) que tem sido caracterizada como um co-receptor de uma classe de ligandos denominados Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) que desencadeiam uma resposta ao aumento dos níveis de ferro por activação da transcrição da hepcidina. Desta forma, a HJV é responsável pela regulação do metabolismo do ferro através da modelação da transcrição do gene da hepcidina. Um maior conhecimento dos mecanismos implicados na regulação da expressão da HJV seria fulcral para um melhor entendimento da importância desta na homeostase do ferro. A sequencia 5’ líder do mRNA da HJV humana possui dois AUGs a montante do AUG principal (uAUGs) que partilham o mesmo codão de terminação formando duas grelhas de leitura a montante da grelha de leitura principal (uORFs) com 28 e 19 codões. De modo a avaliar o efeito destas uORFs na regulação da tradução da HJV foram testadas várias construções repórter, em células HeLa e HepG2, contendo a sequência 5’ líder do mRNA da HJV humana ligada ao cistrão da Luciferase do pirilampo. A actividade da Luciferase foi medida por luminometria e os correspondentes níveis de mRNA quantificados por reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Os resultados mostram que as uORFs presentes no transcrito da HJV diminuem a eficiência de tradução da ORF principal em cerca de 6 vezes. Além disso, foi verificado que os uAUGs sofrem pouco leaky scanning o que contribui para a repressão da tradução da ORF principal. Assim, a reiniciação da tradução é o principal mecanismo envolvido na produção da proteína da HJV. Visando uma melhor caracterização do mecanismo através do qual as uORFs da HJV afectam a tradução a jusante, verificou-se que a sequência peptídica codificada pela uORF2 parece ter a capacidade de bloquear o ribossoma o que impede a tradução da ORF principal. Juntos, estes resultados contribuem para a compreensão de como a expressão do gene HJV é controlada durante o processo de tradução