Forensic entomology: DNA barcoding for coleoptera identification

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012A Entomologia Forense é a ciência que recorre ao estudo de insectos e outros artrópodes e os aplica em investigações do foro legal. Para além de contribuírem para o processo de decomposição do corpo, os insectos podem ainda fornecer informações importantes em investigações criminais. A aplicação mais frequente da Entomologia Medicolegal é a determinação do tempo decorrido desde a morte do indivíduo (intervalo postmortem ou IPM), contudo, existem outras informações importantes como a ocorrência de deslocação do corpo, situações de negligência e associação do corpo com drogas ou toxinas. Apesar da fauna associada ao cadáver incluir uma grande diversidade de artrópodes, Diptera e Coleoptera são as duas principais ordens de insectos que fornecem a maioria da informação em investigações forenses. As espécies pertencentes à ordem Diptera são as primeiras a colonizar o cadáver, sendo que a ordem Coleoptera tem o seu pico, em número e diversidade, durante os estádios mais avançados de decomposição. As espécies de insectos encontradas, assim como o seu padrão de colonização estão dependentes de inúmeros factores, sendo a região geográfica onde se encontram um dos mais importantes. Desta forma, para que seja possível uma aplicação sustentável da Entomologia Forense em investigações do foro legal, é extremamente importante a elaboração de bases de dados específicas para cada região geográfica. A identificação de espécies de insectos encontradas em cadáveres é a etapa mais crucial neste tipo de investigação. Este processo baseia-se na observação directa de caracteres morfológicos e uso de chaves dicotómicas. Contudo, trata-se de uma abordagem demorada e que muitas vezes não permite a identificação de espécimes em estádio imaturo. De modo a ultrapassar estas limitações foi proposta uma identificação molecular que se baseia na sequenciação de uma pequena região do genoma do espécime alvo, denominada por DNA barcode, e que posteriormente é comparada com sequências de referência que se encontram em bases de dados online, pelo que esta ferramenta é designada por “DNA barcoding”. O marcador molecular de eleição, usado no DNA barcoding é o gene mitocondrial Citocromo c oxidase subunidade I (COI). Contudo, a utilização de um único marcador para a identificação de espécies é controversa, pelo que se tem vindo a apostar cada vez mais numa abordagem que envolve outros genes. Uma outra região genómica que tem vindo a ser utilizada com sucesso, incluindo estudos com Coleópteros, é o Citocromo b (Cytb). Desta forma, o presente estudo surge com o principal objectivo de proceder à identificação molecular de espécies com interesse forense, pertencentes à ordem Coleoptera, recolhidas na região de Aveiro, Portugal. Os indivíduos colectados foram identificados morfologicamente procedendo-se, de seguida, à extracção do DNA e posterior sequenciação dos marcadores moleculares COI e Cytb. Deste modo, pretendeu-se testar a eficácia do gene Cytb como marcador molecular e simultaneamente comparar a sua eficiência relativamente ao marcador COI. Neste trabalho foram colectados 35 espécimes de Coleópteros, pertencentes às famílias Staphylinidae, Silphidae, Histeridae, Chrysomelidae, Curculionidae, Nitidulidae, Scarabaeidae e Carabidae. Destes 35 espécimes foram obtidas 30 sequências com 658 pb para o gene COI e 31 sequências com 433 pb para o gene Cytb. Embora a amplificação tenha ocorrido sem grandes complicações para ambos os genes, quando o gene Cytb foi analisado, foi possível verificar que 17 das 31 sequências eram idênticas, mesmo entre indivíduos pertencentes a famílias distintas. Este resultado veio demonstrar que esta região parece ser bastante conservada entre as diferentes espécies, impossibilitando a sua diferenciação. Assim sendo, esta região do Cytb mostrou não ser um bom marcador molecular para ser utilizado no DNA barcoding destas espécies. Todas as sequências obtidas foram comparadas com sequências de referência disponíveis nas bases de dados online GenBank e BOLD, de forma a corroborar a identificação morfológica. Porém, para a grande maioria dos indivíduos não foi possível a confirmação ao nível da espécie, uma vez que o DNA barcoding é uma abordagem relativamente recente e consequentemente ainda existe um grande número de espécies que não se encontra nestas bases de dados, impossibilitando uma comparação. As sequências obtidas neste trabalho irão contribuir para a implementação de uma Base de Dados Nacional, permitindo aumentar o conhecimento de espécies de Coleópteros com interesse forense, em Portugal, e que no futuro poderão ser utilizadas como evidências entomológicas em investigações do foro legal. As sequências serão também submetidas nas bases de dados GenBank e BOLD. As variações intra e interespecíficas foram calculadas relativamente aos dados do COI, usando apenas sequências de indivíduos identificados até ao nível da espécie. Neste tipo de análise é importante ter em conta que o valor de variação intraespecífica deverá ser inferior a 3%, enquanto a variação interespecífica deverá ser superior a este limite, de forma a permitir a diferenciação das espécies. Outro critério está relacionado com a variação interespecífica, que deverá ser 10 vezes superior à média da variação intraespecífica. Contudo, ao analisar os resultados, foi possível observar que os valores de divergência intraespecífica para duas das espécies eram muito superiores ao esperado. Desta forma, foi necessário voltar a analisar a matriz inicial e tentar perceber quais os indivíduos que apresentavam um maior número de diferenças. Estas diferenças poderão estar relacionadas com o facto de os indivíduos terem sido morfologicamente mal identificados, podendo estar a considerar-se indivíduos de espécies diferentes como pertencentes à mesma espécie, obtendo-se assim valores errados. Outro critério usado na delimitação de espécies é a análise filogenética, onde cada espécie deverá surgir como um grupo monofilético. É importante ter em conta que geralmente a sequência barcode não apresenta um sinal filogenético suficientemente forte para determinar relações evolutivas, pelo que a análise destes dados deve ser realizada com precaução. A análise filogenética foi feita para ambos os genes através das metodologias Máxima Verosimilhança, Neighbour-Joining e Máxima Parcimónia. Relativamente à árvore obtida com os dados do COI, foi possível verificar que algumas espécies não agrupavam da forma esperada, o que nos leva a considerar, mais uma vez, que devido ao elevado grau de dificuldade, a identificação morfológica de alguns espécimes terá sido incorrecta. Em relação ao Cytb, visto que foram obtidas 17 sequências idênticas entre si, verifica-se que este gene não tem resolução para estimar relações filogenéticas nas espécies estudadas. Assim, este trabalho vem demonstrar que, na ordem Coleoptera, o COI é um marcador mais adequado do que o Cytb para ser usado no DNA barcoding.Besides the contribution to the body decomposition process, insects are entomological evidences that can provide important information in criminal investigations. In order to study these events, it is essential to accomplish an accurate identification of species founded on corpses. The main goal of this study was to perform a molecular identification of species with forensic interest, belonging to the order Coleoptera. With this purpose, two mitochondrial markers, COI and Cytb, were used. A total of 35 specimens belonging to the families Staphylinidae, Silphidae, Histeridae, Chrysomelidae, Curculionidae, Nitidulidae, Scarabaeidae and Carabidae were collected. Of the 35 Coleoptera specimens, there were obtained 30 sequences with 658 bp for COI gene and 31 sequences with 433 bp for Cytb gene. When Cytb sequences were analysed it was noticed that 17 of the 31 sequences were identical. This region appears to be highly conserved among different species, showing that this fragment is not a good molecular marker to be used for DNA barcoding of these Coleoptera species. Obtained sequences were compared with reference sequences in GenBank and BOLD databases. The majority of studied specimens did not have a sequence to be compared with, showing a lack of reference sequences for a great number of species. Intra and interspecific variation was determined for COI gene, using only specimens identified to species level. In this analysis it was realized that intraspecific divergence values for some species were much higher than expected (>3%). Therefore, the original dataset was reanalyzed to see which individuals presented greatest differences. Phylogenetic analysis was performed for both genes. Regarding the tree based on COI gene data, some species were not grouped as expected, leading us to consider that these specimens have been misidentified morphologically. About Cytb gene, since 17 obtained sequences were identical, phylogenetic analysis for this gene is not suitable. Comparing these two genes, results showed that COI gene is a most suitable marker to be used in DNA barcoding for the order Coleoptera