Fertility preservation: potential ovarian protective effect of GnRH analogues during chemotherapy

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Recent advances in cancer treatment field allowed significant increase in the survival rate of patients. However, the patients have commonly faced long-term adverse effects that severly affected the quality of life, specially concerning their fertility. It is established that radio- and chemotherapy treatments can cause a reduction of the ovarian reserve, resulting in a 40-60% rate of premature ovarian failure (POF) in women exposed to these treatments. In order to decrease POF risks, several fertility preservation options were developed: reduction of the exposure to gonadotoxic agents, gametes or embryos cryopreservation, oocyte donation, ovarian tissue cryopreservation and transplant, or a pharmacological protection of the ovaries during chemotherapy. While the last one appears as a less invasive and promising procedure, the studies and clinical trials continue to show inconsistent results, raising an almost 30-year discussion and controversy. The gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is a hypothalamic hormone responsible for the releasing of gonadotropins. Due to its pulsatile fashion to induce FSH secretion, it was proposed that a continuous saturation of the receptor by synthetic GnRH analogues (GnRHa) could decrease the gonadotropins release and, therefore, could maintain the ovarian follicular pool at immature stages. Once it was suggested that initial stage follicles were less affected by alkylating agents, the women capacity to conceive could then be preserved. By a multiple approach study design, including histological, immunohistochemical, in vitro and in vivo assays in a mouse model, our group intended to better understand the potential preventive effect of GnRHa on the ovaries exposed to chemotherapy and to evaluate the efficiency of GnRH agonists (AGOs) and antagonists (ANTs) in this indication. Our results suggest, so far, that AGOs (triptorelin) and ANTs (cetrorelix) are not efficient to prevent the follicular depletion induced by a cyclophosphamide (Cy) treatment. Nevertheless, the fertility follow-up, until now, seems to show that the birth rate is not affected by neither Cy nor combined Cy-GnRHa treatment, suggesting that the mouse experimental model is not yet optimal.Nos últimos anos, foram feitos enormes avanços no que diz respeito aos tratamentos oncológicos. Estes conseguiram aumentar significativamente as taxas de sobrevivência e o aumento da esperança média de vida dos doentes oncológicos. No entanto, este incremento nem sempre foi acompanhado por uma melhoria na qualidade de vida, nomeadamente na preservação da fertilidade das mulheres sujeitas a tratamentos radio- e quimioterapeuticos. Em média, após este tipo de tratamentos, 40-60% das mulheres são diagnosticadas com falência ovárica precoce (FOP), caracterizada essencialmente por uma diminuição acentuada no número de folículos pertencentes à reserva ovárica de mulheres ainda em idade-reprodutora, derivando consequentemente em amenorreia e, portanto, perda da capacidade de engravidar. Em suma, a FOP é essencialmente definida como uma menopausa prematura em mulheres com idade inferior a 40 anos. A alteração hormonal daí decorrente é comummente associada a um aumento no risco de aparecimento de outras perturbações clínicas, como a osteoporose, doenças cardivasculares e depressão. Desta forma, os serviços oncológicos hospitalares, em parceria com os serviços de ginecologia e obstetrícia, pretenderam desenvolver métodos de prevenção à FOP. A investigação decorrente permitiu a criação de diversas opções à preservação da fertilidade, tais como: a redução da exposição aos agentes gonadotóxicos, a criopreservação de oócitos, embriões ou mesmo de tecido ovárico para posterior transplantação, doação de gâmetas, ou ainda a protecção farmacológica dos ovários durante o tratamento quimioterapeutico. Entre estes, a protecção farmacológica surge como uma excelente opção para a recuperação expontânea da actividade ovárica, uma vez que se trata de um procedimento menos invasivo. Contudo, as conclusões resultantes de diversos estudos e ensaios clínicos geraram uma substancial controvérsia, na medida em que não surgiram ainda dados concretos e consistentes da efectividade dos fármacos na protecção ovárica. Apontados como o produto com maior potencial na prevenção da FOP, a acção de substâncias análogas (agonistas e antagonistas) da gonadotropin-releasing hormone (GnRH) tem sido amplamente estudada, tanto em modelos animais como em ensaios clínicos em humanos. A GnRH é uma hormona sintetizada no hipotálamo, cuja função é o controlo da secreção das gonadotropinas FSH e LH na hipófise anterior. A produção de FSH e LH está dependente de um estímulo de carácter pulsátil da GnRH. Visto isto, a exposição permanente dos receptores hipofisários aos análogos da GnRH (GnRHa) origina uma inibição na secreção das gonadotropinas, que desta forma não acederão ao ovário, impedindo o normal desenvolvimento folicular. Como anteriormente referido existem duas classes de GnRHa: agonistas (AGOs) e antagonistas (ANTs). Os AGOs têm relativamente poucas alterações em comparação com a hormona natural. São igualmente decapéptidos, cujas modificações ocorrem essencialmente ao nível do aminoácido na 6ª posição (glicina), que aumenta o tempo de meia-vida da hormona, protegendo-a da degradação por peptidases; na 10ª posição (glicina carboxiloterminal), que melhora a afinidade do GnRHa ao receptor (GNRHR). Relativamente aos ANTs, estes podem conter múltiplas alterações, ocorrendo sobretudo nas três primeiras posições – região de ligação ao GnRHR. Os GnRHa foram desenvolvidos com vista à alteração da produção de gonadotropinas. Os AGOs induzem primeiramente uma forte secreção, no entanto a contínua administração provoca uma saturação do complexo AGO-GnRHR, originando uma queda acentuada na concentração de FSH e LH circulantes (produzidas e excretadas apenas na existência de uma actividade pulsátil da GnRH). Por outro lado, os ANT actuam por via duma competição com a hormona natural pelo GnRHR, bloqueando estes e suprimindo assim a normal actividade da GnRH na hipófise. Alguns autores propõem que esta actividade inibitória, de ambos os GnRHa, é capaz de proteger a reserva ovárica dos efeitos da quimioterapia, uma vez que esta incide sobretudo nos folículos que se encontram em desenvolvimento. Ou seja, a criação de condições hipopituitárias, poderá impedir a secreção de FSH – hormona essencial ao crescimento e ao recrutamento folicular –, e assim impossibilitar a acção de agentes quimioterapeuticos, cuja intervenção incide sobretudo nas células com actividade proliferativa. Concretamente, a nível das células da granulosa – células do folículo ovárico de maior actividade mitótica. As primeiras demonstrações de um possível efeito protector dos GnRHa num ovário exposto a quimioterapia ocorreram nos anos 80, em experiências que utilizavam o rato como modelo. Estas apresentaram resultados animadores, uma vez que o AGO utilizado conseguia diminuir a depleção de folículos ováricos de ratos tratados simultaneamente com ciclofosfamida (agente quimioterapeutico). Posteriormente, um estudo com macacos rhesus demonstrou que a ciclofosfamida destruía 65% dos folículos primordiais, enquanto que um co-tratamento com AGO reduzia esta população folicular em apenas 29%. No entanto, outros estudos demonstraram diferenças não significativas entre as várias condições analisadas, levantando então dúvidas relativamente ao sucesso dos AGOs na preservação da fertilidade. Comparativamente, o uso de ANTs em modelos animais expostos a tratamentos quimioterapeuticos, demonstrou alguns casos promissores, mas não na totalidade. Um estudo recente, apresentou uma menor depleção da reserva folicular em ratinhos co-tratados com ciclofosfamida e cetrorelix (ANT), quando comparada com os ratinhos expostos apenas à ciclofosfamida. Contudo, outro estudo afirmou que, embora a diferença nas contagens de folículos efectivamente ocorresse, a diminuição não se repercutia posteriormente numa diferença significativa no número de crias por ninhada, nas várias condições analisadas. No que respeita à investigação em humanos, diversos estudos foram já realizados, porém com a controvérsia da acção dos GnRHa na protecção do ovário a manter-se. As conclusões de inúmeros estudos foram postas em causa, devido à metodologia utilizada e ao carácter incompleto de alguns ou pelo reduzido número e em enviesamento da amostra de outros. No entanto, ensaios clínicos mais recentes, cuja pretensão se centrou na avaliação mais rigorosa do efeito dos GnRHa, continuam a fornecer resultados preliminares e conclusões inconsistentes e díspares uns dos outros. Mantendo-se assim a discussão sobre o verdadeiro efeito dos GnRHa nos ovários de mulheres submetidas a quimioterapia, e desconhecendo-se igualmente os mecanismos fisiológicos subjacentes à acção destes. Visto isto, o presente estudo pretendeu melhor elucidar o potencial efeito protector dos GnRHa nos ovários durante a quimioterapia, assim como comparar a eficácia de AGOs e ANTs no desempenho desta função preventiva. Recorrendo ao ratinho como modelo, este estudo contem diferentes abordagens, de forma a tentar responder com complementaridade a diversas questões, avaliando assim de forma mais generalizada o papel dos GnRHa: a reserva ovárica foi avaliada através de contagem folicular por fase de desenvolvimento, recorrendo a técnicas histológicas (coloração hematoxilina e eosina); as taxas de proliferação celular e apoptose foram avaliadas por imunohistoquímica (ki-67 e caspase-3, respectivamente); o desenvolvimento folicular foi analisado através de culturas in vitro (12 dias em meio de crescimento + 1 dia em meio de maturação, e consequente desnudagem e avaliação do estado de maturação do oócito); a fertilidade foi estudada a partir do acompanhamento das ninhadas produzidas; a competência do oócitos foi verificada pela técnica de fertilização in vitro (embora os resultados não sejam apresentados neste estudo). Seis condições de tratamento foram definidas: controlo – aos ratinhos fêmea foi diariamente administrada uma injecção subcutânea (sc) de uma solução salina (NaCl) e uma única injecção intraperitoneal (ip) foi aplicada, igualmente, com NaCl; controlo-quimioterapia – sc diária NaCl e uma única ip de ciclofosfamida (Cy); controlo-ANT – sc diária cetrorelix e uma única ip NaCl; ANT-quimioterapia – sc diária cetrorelix e uma única ip Cy; controlo-AGO – sc diária triptorelin e uma única ip NaCl; AGO-quimioterapia – sc diária triptorelin e uma única ip Cy. Os ratinhos fêmea receberam tratamento base durante 21 dias e a ip foi administrada no dia 13. No dia do sacrifício foi recolhido sangue, com recurso a uma punção intracardíaca; a cada dois dias das culturas foliculares in vitro o meio de cultura era colhido, renovado e armazenado. Todas as colheitas armazenadas serviram posteriormente para que análises hormonais fossem efectuadas. A comparação entre o efeito produzido pelo AGO e ANT na reserva folicular, demonstrou que o grupo controlo foi aquele cujo número de folículos em estados iniciais – primordiais e primários – era mais elevado (441 ± 153). Embora as diferenças notadas não tenham atingido valores estatisticamente significativos (p=0,358), o grupos controlo-ANT e controlo-AGO apresentaram um decréscimo, respectivamente, de 17% e 23%, em comparação com o controlo. Relativamente aos grupos tratados com Cy, todos demonstraram novamente valores proporcionais inferiores (comparativamente ao controlo): Cy – menos 32%; ANT+Cy – menos 39%; AGO+Cy – menos 44% (o único a atingir valores significativos, p=0,022). Os folículos em crescimento – secundários, early antrais e antrais – apresentaram contagens sem diferenças significativas entre todas as condições. A proporção relativa dos vários estadios de desenvolvimento folicular demonstraram valores muito próximos, entre todas as condições. A percentagem de folículos em estados iniciais variou entre 66-78% e a de folículos em crescimento 22-34%. Testes imunohistoquímicos preliminares à proteína ki-67 parecem marcar preferencialmente as células da granulosa de folículos em crescimento. No que concerne as culturas foliculares in vitro, a taxa de sobrevivência foi semelhante em todas as condições, assim como na taxa de maturação ovocitária. Todas as condições apresentaram uma taxa de oócitos em meiose II entre 51-67%. A produção de progesterona (24h) também não apresentou diferenças significativas entre condições, tendo o grupo controlo revelado uma produção de 2,89 ng/mL. O acompanhamento dos nascimentos ocorridos não demonstrou, até ao momento, nenhuma diferença entre os vários grupos analisados. Os resultados até agora obtidos parecem sugerir uma ausência de efeito protector na reserva folicular, aquando o uso de GnRHa em ovários expostos a ciclofosfamida. No entanto, o projecto encontra-se ainda a decorrer, pelo que mais e melhores informações deverão elucidar de forma mais clara o verdadeiro papel dos GnRHa no ovário submetido a tratamento quimioterapeutico