Population analysis of Hyla arborea and Hyla meridionalis (Amphibia, Anura) in Portugal:a molecular genetic and bioacoustic approach

Tese de doutoramento, Biologia (Biodiversidade), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The focus of this work is on the species of Hylids (Amphibia, Anura) present in Portugal, Hyla meridionalis and Hyla arborea (=H. molleri), to examine the geographic patterns of genetic and mating calls diversity. The aim is to determine the patterns of variation of genetic and bioacoustic markers between populations, exploring how the current distribution patterns were influenced by the origins, colonization events of both species, and finally their evolutive history. For comparison and biogeographically integrative reasons, information from outside Portugal is used. The genetic and bioacoustic analyses revealed different diversity patterns among the studied populations of both species. Iberian H. arborea is highly divergent from European taxon, supporting the ressurection of H. molleri species. Within Iberia two distinct groups, ‘North’ and ‘South’, were identified, having the southern one higher haplotype diversity, a pattern seen in other Iberian amphibians. A different pattern was however seen at the bioacoustic level. Populations did not cluster into groups, and no significant differences were found between populations. In H. meridionalis COI analysis corroborated previous results, with three well differentiated clades identified, all with little genetic diversity within groups. Tunisia and Algeria specimens were highly divergent from all other, suggesting an ancient split between the two lineages. Advertisement calls showed little diversity between populations. In syntopy, the presence of males of the other species calling apparently has little effect on advertisement calls: only frequencies and call duration of H. meridionalis were significantly smaller in sympatry. Being unlikely the hypothesis of reproductive character displacement of mating calls. This, together with the absence of F1 hybrids in the studied sites (although earlier studies have reported their presence) and of any sign of introgression in adults and tadpoles, suggests a rare occurrence of heterospecific mating, and that advertisement calls are an effective premating barrier.As relas do género Hyla da Europa e do Norte de África pentencentes à família Hylidae, da ordem dos Anuros, repartem-se por duas espécies na Península Ibérica, a rela-europeia, Hyla arborea e a rela-meridional, H. meridionalis. Durante muito tempo estas duas espécies, bem como outras do mesmo género que habitam o continente europeu, eram consideradas meras subspécies de H. arborea. Estudos morfológicos, genéticos e bioacústicos foram contudo determinando a atribuição do seu carácter de espécie a muitas destas formas. Actualmente são 16 reconhecidas espécies repartidas por dois grandes grupos, H. arborea e H. japonica, correspondentes aos extremos da sua área de distribuição global, uma a ocidente da Eurásia e outro no seu extremo Oriental. Considerada uma espécie distinta da sua congénere por critérios morfológicos, imunológicos e bioacústicos (estes últimos salienta-se serviriam de base ao seu reconhecimento original. A H. meridionalis, é peculiarmente o único Hilídeo que ocorre em África. As chamadas de acasalamento dos machos, comparadas com as da H. arborea, são mais longas (aproximadamente cinco vezes para a mesma temperatura ambiental) e mais graves (as suas frequências são relativamente mais baixas). Estudos genéticos recentes baseados na análise de ADN mitocondrial e nuclear, sugerirem que a H. meridionalis se caracteriza por uma baixa diversidade genética patente nas amostras provenientes dos dois clados bem diferenciados: 1) um ocidental que inlcui Marrocos, o Sudoeste da Europa (incluindo a Península Ibérica) e as ilhas Canárias e 2) um oriental que inclui a Tunísia. As amostras pertencentes à Tunísia formariam um clado altamente divergente das restantes, o que sugere ter havido uma separação bastante antiga destas duas linhagens. A presente distribuição da espécie teria resultado de dois grandes eventos de dispersão a partir do Norte de África provavelmente recentes (e a introdução, mediada por humanos ou em ‘jangadas’ naturais arrastadas por correntes, nas Ilhas Canárias e na Madeira). Um primeiro evento de dispersão, mais antigo, teria ocorrido com a colonização do Sul da Península Ibérica por indíviduos vindos originalmente do Sul de Marrocos, que teriam migrado primeiro para o Norte de Marrocos e daí para a Península Ibérica. Num segundo evento, mais recente, como atrás referimos, alguns elementos provenientes do Norte de Marrocos teriam sido introduzidos na costa mediterrânica de França e daí migrado para Norte, Este e Sul, ocupando o Sul de França e o Nordeste de Espanha. As diferenças encontradas entre estes indivíduos e os do primeiro evento de expansão (pertencem a dois grupos distintos), podem ser resultado de uma recolonização do Norte de Marrocos, após a primeira dispersão para o continente europeu, por uma população com algum grau de diferenciação genética em relação aos primeiros. Quanto à H. arborea, os seus estudos são geralmente mais abrangentes do ponto de vista geográfico, uma vez que a distribuição da espécie se estende desde a Europa Central até à Pensínsula Ibérica. Recentemente, a descrição da variabilidade genética ao nível dos ADN mitocondrial e nuclear, de muitas das suas populações europeias, demonstrou a existência de grupos altamente diferenciados e com uma forte associação com a sua distribuição geográfica. Alguns desses grupos correspondem a espécies actualmente aceites como espécies distintas de que falámos, como são os casos da H. sarda (endémica da Sardenha e da Córsega), H. orientalis (presente na Europa do Leste, nomeadamente, Ucrânia, Roménia e Turquia), H. savignyi (Médio Oriente, incluindo Chipre, Turquia, Síria, Irão e Iraque), e da H. intermedia (sul de Itália, na Península Apenina e na Sicília). Um dos resultados concordantes nos vários estudos realizados foi a acentuada diferenciação genética entre H. arborea da Europa Central e a da Península Ibérica, tendo sido, por isso, proposta a ressureição, da antiga sugestão, do carácter de espécie distinta para a forma da Península Ibérica, Hyla molleri Bedriaga 1890. Na Península Ibérica estas duas espécies ocorrem em simpatria numa vasta área das suas distribuições geográficas, e são conhecidas várias situações de sintopia em que indíviduos das duas espécies partilham o mesmo charco (ou outra zona húmida). Através do canto de acasalamento, foram detectados híbridos (machos, dados serem estes os únicos a emitir chamadas) em Portugal e Espanha. Todos os híbridos encontrados apresentavam características intermédias às das espécies parentais relativamente às chamadas de acasalamento, aos padrões de variação de aloenzimas (híbrido encontrado em Portugal). A nível morfológico, a banda lateral em alguns elementos estendia-se até metade dos flancos ou apresentava um ‘escudo’ rudimentar na região inguinal (típico da H. arborea). Todos os indivíduos híbridos capturados, revelaram ser estéreis, com testículos sem células espermatogénicas. Com base nestes conhecimentos prévios, estabelecemos como objectivo central desta tese o aprofundar do estudo sobre a história evolutiva de H. arborea e H. meridionalis, na tentativa de avaliar, confirmando ou infirmando as hipóteses anteriormente formuladas com recurso a uma dupla abordagem genética e bioacústica, acerca dos vários aspectos que poderiam informar o melhor conhecimento do que podemos considerar as suas filogeografias e interrelação no nosso território. Assim, mais especificamente propusemo-nos 1) determinar os padrões biogeográficos da diversidade genética das populações das duas espécies na Pensínsula Ibérica (sobretudo em Portugal), utilizando diferentes marcadores moleculares, fazendo uma re-análise dos padrões filogeográficos, anteriormente propostos, ao nível da Europa e do Norte de África e uma análise a uma escala mais fina dos padrões ibéricos e mais em particular dos de Portugal; 2) paralelamente procurámos investigar quais os padrões geográficos da diversidade bioacústica em Portugal ao nível dos cantos de acasalamento dos machos de ambas as espécies, pelas potencialidades que este tipo de abordagem oferece em termos de contribuições de índole ecológica e evolutiva; e 3) tentar obter informação acerca das relações interespecíficas através da análise integrada de dados genéticos e bioacústicos, explorando aspectos ligados a eventuais processos de hibridação/introgressão das duas espécies e correlativamente da ocorrência de fenómenos de ‘deslocação de caracteres’. Nestas espécies para conseguirmos concretizar os objectivos propostos apostámos numa abordagem dupla e complementar, baseada na análise de dados genético-moleculares e bioacústicos. Para fazer face à parca amostragem, em estudos destas espécies, efectuados em Portugal, o esforço de amostragem (para recolha de tecido e para gravações áudio dos cantos de acasalamento) foi significativamente aumentado, tentando-se cobrir uma área bastante mais abrangente da área de distribuição das espécies. A amostragem de campo decorreu entre 2005-2010. Recolheram-se amostras de tecido de indivíduos adultos e de girinos e foram gravados os cantos de acasalamento dos machos de ambas as espécies. Para completar a cobertura geográfica no que refere a recolha de amostras para ulterior estudos genéticos, foram aproveitadas amostras cedidas por outros investigadores, bem como se usaram as sequências já publicadas em estudos anteriores. O gene escolhido do ADN mitocondrial foi o Citocromo Oxidase I (COI) dado ter já sido utilizado noutros estudos para estas mesmas espécies. No que concerne ao estudo das interacções das espécies, através da técnica de RFLP (do inglês, ‘Restriction Fragment Length Polymorphism’) testaram-se os indivíduos provenientes de locais sintópicos na busca de possíveis híbridos F1 e, paralelamente, compararam-se os pârametros dos cantos de acasalamento de machos de locais sintópicos com os de locais alopátricos (que serviram de referência). No que diz respeito à H. arborea, da análise das sequências de COI obtidas, confirmou-se a grande divergência entre o grupo europeu e ibérico, com um distância genética (p-uncorrected) de 0.125. Da análise destes dados resultou a obetnção de uma árvore filogenética robusta, em que estes dois clados são suportados por elevados valores de bootstrap. Corrobora-se assim a proposta expressa em estudos anteriores de revalidar a espécie Ibérica, H. molleri. Analisando separadamente as sequências obtidas de elementos da Península Ibérica obtiveram-se dois ‘grupos’, aqui denominados por ‘Norte’ e ‘Sul’, mas sem grande suporte ao nível da árvore filogenética. Os haplótipos pertenecentes ao grupo do ‘Norte’ distribuem-se na sua maioria a Norte do rio Mondego e no Noroeste de Espanha; os haplótipos do grupo ‘Sul’ ocupam as áreas a sul do rio Mondego e a costa Atlântica Nordeste da Ibéria. O último grupo apresenta uma diversidade haplotípica mais elevada que o grupo ‘Norte’, contrariando resultados de estudos anteriores efectuados para esta espécie, mas que estão de acordo com estudos efectuados sobre outros anfíbios ibéricos/portugueses. Ao nível da acústica não se observou este padrão com uma divisão Norte-Sul. Pelo contrário os parâmetros dos cantos de acasalamento revelaram-se homogéneos entre os vários locais amostrados, excepção feita ao local amostrado na Serra da Estrela (CFO) cujos valores da duração dos ‘grupos de chamadas’ e o número de chamadas por ‘grupo de chamadas’ são significativamente maiores que os dos demais locais amostrados. Esta diferença, não reflectida ao nível do ADN mitocondrial, poderia ser explicada pela altitude, tratando-se de um local acima dos 1500 m. Seria importante, no entanto, amostrar outros locais a altitudes semelhantes para comparar os cantos. Os padrões de diversidade genética de H. meridionalis estudados através da sequenciação do gene COI, revelaram a existência de dois clados robustos com elevados valores de bootstrap, um incluindo haplótipos da região da Tunísia e Argélia (TA) e outro que se subdivide em três subclados distintos, um de Marrocos Central (CM), e os outros dois subclados que partilham haplótipos com o Norte de África e a Europa. Um deles, denominando por ‘Norte de Marrocos’ (NM) inclui haplótipos de amostras provenientes do Norte de Marrocos e, na Europa, do Nordeste Ibérico, Sul de França e Itália, e também das ilhas Canárias. O outro subclado denominado ‘Sudoeste’ inclui haplótipos do sudoeste de Marrocos e do sudoeste da Península Ibérica. Estes resultados estão de acordo com os obtidos em estudos anteriores, e em conjunto com a baixa diversidade genética encontrada nos grupos Ibéricos quando comparados com os Africanos bem como a presença de haplótipos partilhados dos dois lados do Estreito de Gibraltar, vêm ao encontro da hipótese de ter havido uma colonização recente da Península Ibérica. A divergência entre o clado TA e os demais sugere uma divergência já antiga destes grupos, sendo até possível que se trate de um grupo tão diferenciado que possa pertencer a uma subespécie ou até espécie distinta. No subclado NM a presença de haplótipos partilhados aponta para uma colonização mais recente da Ibéria que a do subclado SW, em que não há partilha de haplótipos entre a Ibéria e África. No entanto, em qualquer dos casos, os baixos valores de diversidades haplotípica suportam a hipótese de uma colonização recente, pós abertura do Estreito de Gibraltar (~5.33 Mya, após a Grande Crise Messiânica durante a qual o Mediterrâneo ocidental secou), levando a supor que ou os animais terão usado ‘jangadas’ naturais ou então teriam sido transportados por humanos. Os cantos de acasalamento dos machos seguem este padrão de baixa diversidade entre populações, observado ao nível do ADN mitocondrial, não se verificando diferenças significativas. No que respeita ao nível do estudo da interacção das duas espécies, ao contrário do esperado, não foram encontrados elementos relevantes, nomeadamente da ocorrência de híbridos na natureza. Apesar do esforço de amostragem efectuado nas zona sintópicas, a análise de RFLP não revelou a presença de nenhum híbrido F1 ou retrocruzamento. Igualmente, da análise dos parâmetros dos cantos de acasalamento não se encontraram quaisquer indicíos que pudessem apontar nesse sentido. No entanto, a análise dos cantos mostrou que quando em simpatria os machos de H. meridionalis alteram alguns dos parâmetros das suas chamadas de acasalamento. Quer a frequência fundamental quer a frequência dominante apresentam valores médios mais baixos em situações de sintopia, assim como na duração das chamadas que foi, em média, inferior. Será difícil justificar com certeza a razão para estas diferenças, sendo que estudos sobre as preferências fonotácticas de fêmeas e experiências de playback com machos poderão ajudar a esclarecer esta matéria. No seu conjunto, os resultados obtidos realçam a importância da utilização de duplas abordagens como utilizámos, em que vias, em princípio, mais ou menos independentes, são usadas de forma complementar para tentar responder às questões referentes à determinação dos padrões espaciais e temporais da estrutura populacional destas espécies (e dos anuros e outros vertebrados em geral). O que fica ainda por esclarecer obriga à realização, idealmente num futuro próximo, de estudos utilizando de forma efectiva vários marcadores moleculares nomeadamente microssatélites, em particular no caso da H. arborea/H. molleri para tentar discernir qual a zona de fronteira entre as espécies e esclarecer melhor a estruturação populacional evidenciada pela existência dos dois grupos, ‘Norte’ e ‘Sul’. O uso de microssatélites e outros marcadores nucleares irá favorecer o estudo ainda mais aprofundado de potenciais casos de hibridação/introgressão, utilizando-se a acústica para explorar o valor que representam os cantos de acasalamento como barreira reprodutiva eficaz entre as espécies.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/16446/2004