Pseudomonas fluorescens: the effect of evolution on the effectiveness of lytic phage as a control agent

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Antibiotic resistance in pathogenic bacteria is an increasing concern in health programs, and a number of alternatives are currently under investigation. One promising alternative is phage therapy, the use of specific bacteriophages to control or eradicate pathogenic bacteria. Despite having many advantages, the use of phages still presents some limitations and requires experimental investigation. Phage therapy benefits from the abilities of phages to multiply in situ and evolve, but bacteria can also evolve resistance to phages, in a process called antagonistic coevolution. Through the coevolution and evolution of wild type and mutator strains of Pseudomonas fluorescens and its lytic phage φ2, this study sought to determine how the nature of selection affects phage killing efficiency. Phages were sequentially transferred either with bacteria (coevolution) or passaged on the ancestral bacteria (evolution). The efficiency of phages from three time points (transfers 1, 4 and 8) was estimated by plating on ancestral and allopatric coevolved bacteria. The results indicate that the coevolution treatment leads to a greater increase in phage efficiency than the evolution treatment. This is specially seen when phage populations are confronted with mutator coevolved bacteria, which may be due to a specialization cost to the evolved phage populations. Wild type coevolved bacteria were resistant to all allopatric phages, whether from the past, present or future. Phage infectivity to ancestral bacteria peaked early in the transfer regime. Further studies are necessary to confirm these results and should consider the effects of phage dose.O alastramento de infecções hospitalares com bactérias resistentes a antibióticos têm vindo a aumentar nos últimos anos. A evolução de bactérias resistentes a antibióticos tem sido acelerada, em parte, devido ao excessivo uso destas substâncias, durante mais de meio século, não só no tratamento médico de pacientes, mas também na criação de animais para consumo humano. Também a evolução de resistência simultânea a múltiplos antibióticos tem vindo a aumentar em bactérias patogénicas graças à existência de elevadas taxas de mutação e à ocorrência de transmissão horizontal de genes. Por outro lado, os custos da resistência a antibióticos tendem a diminuir rapidamente no curso da evolução, o que faz com que a simples suspenção temporária do uso de um dado antibiótico não seja suficiente para eliminar os genótipos resistentes. Também uma diminuição na produção de novos antibióticos tem vindo a tornar clara a necessidade de criação de alternativas à simples administração de um antibiótico. Algumas alternativas incluem a alternância do uso de mais do que uma classe de antibióticos ao longo de vários meses ou anos e o uso simultâneo de diferentes antibióticos em diferentes pacientes no mesmo hospital (chamado “mixing”) ou no mesmo paciente. Outros métodos incluem a utilização de hidrolases da parede celular bacteriana (enzimas que degradam o principal constituinte da parede celular bacteriana, os peptidoglicanos, levando à lise celular e podendo ter origem em células eucarióticas, bacterianas e em bacteriófagos) e de péptidos antimicrobiais (péptidos com grande actividade bactericida e também com origem em células eucarióticas, bacterianas e em bacteriófagos). Embora apresentem algumas características promissoras, como a baixa capacidade que as bactérias apresentam para evoluir resistência a algumas destas moléculas, elevados custos de produção e a sua potencial toxicidade fazem com que estes métodos ainda necessitem de aperfeiçoamento antes que possam ser aplicados. Uma outra alternativa à utilização de antibióticos é a terapia fágica, que consiste na utilização de bacteriófagos (ou fagos) específicos para erradicar ou controlar bactérias patogénicas. Após a descoberta, no início do século 20, da capacidade dos fagos de matarem bactérias, esta técnica foi durante várias décadas desenvolvida e aplicada apenas nos países da ex-União Soviética. Apenas recentemente voltou a ser considerada nos países Ocidentais, dada a urgência em desenvolver alternativas à utilização de antibióticos. Os bacteriófagos têm várias vantagens face ao uso de antibióticos, entre as quais se podem destacar o facto de se multiplicarem exponecialmente no local da infecção; serem bastante específicos no seu hospedeiro, o que protege a flora normal do organismo do paciente e diminui o número de estirpes bacterianas que lhes poderão evoluir resistência; serem eficientes contra bactérias resistentes a antibióticos; e poderem ser combinados com outros fagos ou com antibióticos para aumentar a sua eficácia. No entanto, a terapia fágica também apresenta algumas limitações, como o facto de os fagos utilizados para este fim terem de ser obrigatoriamente fagos líticos (que injectam o seu material genético dentro das células bacterianas e libertam a sua progenia através da indução da lise bacteriana); com uma baixa capacidade de transferir material genético entre células bacterianas; e, preferencialmente, com o seu genoma totalmente sequenciado (para evitar a presença de genes indesejados, como os que codificam proteínas tóxicas para os pacientes). A existência da várias limitações à aplicação da terapia fágica sublinha a importância da investigação nesta área, para garantir uma adequada selecção e formulação dos fagos utilizados. A capacidade que os fagos têm de evoluir in situ pode também ser considerada como uma desvantagem, dado o facto de tornar o seu comportamento algo imprevisível. No entanto, esta característica está na base da sua capacidade de se adaptarem ao seu hospedeiro. Infelizmente, as bactérias têm também a capacidade de evoluir resistência aos fagos, originando um processo designado por coevolução antagonística entre um parasita e o seu hospedeiro: o hospedeiro evolui resistência ao seu parasita devido à selecção exercida pelo parasita e, reciprocamente, ocorre a evolução da infectividade do parasita, contrapondo assim os mecanismos de defesa do hospedeiro. Os microorganismos são um modelo que apresenta bastantes vantagens para o estudo da evolução e coevolução, como o facto de terem tempos de geraçãos curtos e serem fáceis de manter em grande número, o que lhes permite evoluirem rapidamente no decurso de uma experiência. Outra vantagem é o facto de poderem ser congelados indefenidamente, o que permite a comparação de diferentes pontos temporais do processo evolutivo. Este estudo utilizou o sistema Pseudomonas fluorescens SBW25 e o seu fago lítico associado ɸ2 (onde já foi demonstrada a ocorrência de coevolução antagonística) para estudar o efeito da evolução e coevolução na capacidade dos fagos de matarem bactérias (um dos prerequesitos da terapia fágica). O seu objectivo é contribuir para o desenvolvimento de um protocolo experimental que aumente a eficiência dos fagos, melhorando assim o controlo de bactérias patogénicas. Estudos anteriores verificaram que estes diferentes tipos de selecção afectam diferentemente a virulência dos fagos. Nesta experiência, os fagos foram coevoluídos (transferidos sequencialmente em conjunto com as bactérias) ou evoluídos (transferidos sequencialmente para as bactérias ancestrais) com duas estirpes de P. fluorescens, wild-type (WT) e mutS- (mutS) (um “hypermutator”). A estirpe mutS SBW25 tem um knockout no gene mutS, o que lhe confere uma taxa de mutação aproximadamente 100 vezes superior à do WT (mutS tem uma taxa de mutação de c 5x10-5 mutações por par de bases, por geração). Esta estirpe foi utilizada devido ao facto de bactérias com elevadas taxas de mutação (“mutators”) serem frequentemente encontradas em populações naturais e laboratoriais e estarem frequentemente associadas a infecções clínicas. Experiências laboratoriais demonstraram também que estas bactérias têm uma maior probabilidade de evoluir e conservar resistência a antibióticos na presença de fagos. Foram realizadas 8 transferências sequenciais (uma a cada 48h). As populações fágicas iniciais cresceram a partir de culturas de WT ou mutS ancestrais e foram estimadas através do seu plaqueamento em tapetes bacterianos (da mesma estirpe ancestral na qual cresceram) e da contagem no número de placas fágicas (PfUs). 24 microcosmos com fagos e bactérias foram preparados, cada um através da adição de c 104 partículas fágicas, vindas da população inicial, e de 60μl de bactérias crescidas overnight (c 107 células) a 6ml de meio Kings B (KB). Em 12 destas populações, os fagos foram confrontados com bactérias WT e, nas outras 12 populações, com bactérias mutS. Metade das réplicas de cada tratamento foram coevoluídas, sendo que a cada passagem foram transferidos 60μl de cultura para novos microcosmos com 6ml de meio KB. Na outra metade das réplicas de cada tratamento (evolução), os fagos foram isolados a cada passagem, e 60μl de solução fágica, juntamente com 60μl da estirpe bacteriana ancestral correspondente crescida overnight, foram transferidos para um novo microcosmos com 6ml de meio KB. Foram guardados stocks a -80ºC. Fagos de três pontos temporais (transferências 1, 4 e 8) foram isolados e todas as populações fágicas foram testadas em tapetes bacterianos de bactérias WT e mutS, quer ancestrais, quer previamente coevoluídas até à 4ª transferência (numa experiência preliminar, portanto as bactérias eram alopátricas aos fagos). A densidade de partículas fágicas que mataram bactérias (a eficiência fágica) foi estimada através da contagem de placas fágicas. Os fagos coevoluídos mostraram-se mais eficientes do que os fagos evoluídos, embora exista a possibilidade de haver um efeito de dose (o aumento no número de fagos observado pode reflectir um aumento na eficiência de ataque por partícula fágica ou um aumento no número de fagos). Para corrigir um possível efeito de dose foram testados modelos estatísticos em que o número de fagos foi expresso em relação ao número de fagos obtido nas bactérias WT ancestrais. Foi demonstrado que as bactérias WT ancestrais não são sensíveis a todos os fagos, o que indica que o número de fagos pode ser subestimado nestas bactérias. Todas as bactérias coevoluídas mostraram-se mais resistentes aos fagos que as ancestrais. As bactérias WT coevoluídas (até t4) mostraram-se totalmente resistentes a todas as populações de fagos (alopátricos), quer estes fossem coevoluídos ou evoluidos (em bactérias WT ou mutS), e quer fossem fagos do passado (t1), presente (t4) ou futuro (t8). Isto poderá estar relacionado com a aquisição de custos de resistência. Já as bactérias mutS coevoluídas (até t4) mostraram-se sucessivamente mais sensíveis as fagos t1, t4 e t8. Estas bactérias poderão ter uma desvantagem face aos fagos (em comparação com as bactérias WT). Também as populações de fagos coevoluídos mostraram-se mais eficientes quando confrontadas com as bactérias coevoluídas do que as populações de fagos evoluídos, o que pode dever-se ao facto de os fagos evoluídos em bactérias ancestrais sofrerem um custo nas bactérias coevoluídas. Todas as populações fágicas aumentaram em eficiência até à 8ª transferência face às bactérias mutS coevoluídas. No entanto, quando confrontados com as bactérias ancestrais, os fagos aumentaram maioritariamente a sua eficiência até t4, tendo-a mantido entre t4 e t8. Isto pode indicar que os fagos atingiram o seu pico de eficiência face às bactérias ancestrais após um curto número de transferências e que, no caso dos fagos coevoluídos, estes poderão sofrer custos de especialização. Devido ao potencial efeito de dose, mais estudos serão necessários para confirmar estes resultados