Metabolic switch in uterine cervix cancer: in vitro study of adenocarcinoma (HeLa) and squamous cell carcinoma (SiHa) cell lines

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012O cancro é uma doença complexa que envolve numerosas alterações na fisiologia da célula que conduzem, em última instância, a tumores malignos. Os processos biológicos através dos quais as células normais são transformadas em células cancerígenas malignas têm sido alvo de vasta investigação durante várias décadas (Seyfried & Shelton, 2010). Existem seis alterações essenciais na fisiologia celular que estão na base do crescimento celular maligno e são a auto-suficiência em termos de sinais de crescimento, a insensibilidade a sinais inibidores de crescimento, a evasão à morte celular programada (apoptose), um potencial replicativo ilimitado, a angiogénese sustentada e a invasão tecidular e metastização (Hanahan & Weinberg, 2000). Contudo, recentemente, têm sido propostos outros atributos distintos às células cancerígenas funcionalmente importantes para o desenvolvimento de cancro, que incluem a reprogramação do metabolismo energético celular, por forma a suportar o crescimento celular e a proliferação contínua, e a evasão ao controlo imunitário (Hanahan & Weinberg, 2011). Ao longo da última década, os tumores têm sido identificados como órgãos cuja complexidade pode exceder a dos tecidos saudáveis normais, contrastando com a anterior visão reducionista dos tumores como um conjunto relativamente homogéneo de células cancerígenas. Desta forma, a biologia de um tumor só pode ser entendida analisando os tipos celulares especializados que o constituem bem como a microambiente tumoral criado durante o processo de tumorigénese (Seyfried & Shelton, 2010) . Em termos de incidência global, estima-se que 12.7 milhões de novos casos de cancro e 7.6 milhões de mortes causadas por cancro ocorram por ano (Ferlay et al., 2010). O cancro do colo do útero é o terceiro cancro mais comum entre as mulheres, e o sétimo globalmente (Ferlay et al., 2010; Yugawa & Kiyono, 2009), sendo a quarta causa de morte por cancro entre as mulheres, mundialmente (Jemal et al., 2011; Ferlay et al., 2010). Apesar de a incidência deste tipo de tumor ter diminuído nos países desenvolvidos, a incidência mundial estimada ronda os 500 000 novos casos por ano (Jemal et al., 2011; Yugawa & Kiyono, 2009). Em Portugal, o cancro do colo do útero surge como o quarto mais frequente entre as mulheres (Globocan, 2008). Em termos histológicos, existem duas variantes de cancro do colo do útero com significado clínico, os adenocarcinomas (AC) (que compreendem 10 a 25 % dos casos) e os carcinomas pavimento celulares (SCC) (que compreendem cerca de 85 a 90% dos casos) (Chan et al., 2003; Smith et al., 2000). Sabe-se que em algumas doentes, o tumor apresenta um crescimento endofítico, invadindo o endométrio, enquanto noutros casos, o tumor cresce exofíticamente para o canal da vagina (Nguyen & Averette, 1999). Além disso, neste tipo de tumor, a composição da flora vaginal, concretamente, a presença de Doderlein bacilli, bacilo que possui a capacidade de converter o glicogénio presente na mucosa vaginal em ácido láctico, contribui para a criação e manutenção de um microambiente rico em ácido láctico que pode desempenhar um papel na selecção das células cancerígenas e na progressão tumoral (Gupta, 2011; Redondo-Lopez et al., 1990). O virus do papiloma humano (HPV) é o agente etiológico do cancro do colo do útero, contudo, a infecção por HPV não é o único factor envolvido na carcinogénese do carcinoma do colo do útero (Yeasmin et al., 2011). Alterações genómicas em oncogenes e genes supressores de tumor nas células do colo uterino são também essenciais ao desenvolvimento de carcinoma do colo do útero (Yeasmin et al., 2011). A amplificação genética em certas regiões cromossómicas é um dos mecanismos de activação de vários oncogenes e outros genes relacionados com o desenvolvimento e progressão tumoral (Schwab, 1999). Estudos em carcinoma do colo do útero, revelaram que os receptores do factor de crescimento epidérmico (EGF) e o proto-oncogene c-Myc estão frequentemente activados por amplificação e estão claramente associados ao fenótipo maligno (Hale et al., 1993; Pfeiffer et al., 1989). As células tumorais reprogramam o seu metabolismo energético de forma a sustentar as elevadas taxas proliferativas (Tennant et al., 2009; DeBerardinis et al., 2008). Além disso, esta reprogramação permite-lhes resistir a alguns sinais de morte celular, particularmente aqueles mediados por danos oxidativos (King & Gottlieb, 2009). Para se dividir uma célula necessita de aumentar em tamanho mas também de replicar o seu DNA – processos que são altamente exigentes do ponto de vista metabólico e que requerem grandes quantidade de proteínas, lípidos e nucleótidos, tal como energia no forma de ATP, o que implica um aumento no consumo de glucose e aminoácidos (Tennant et al., 2010). O fenótipo metabólico melhor caracterizado que se observa nas células tumorais é o efeito de Warburg, que consiste no cancelamento do ciclo de Krebs e cadeia transportadora de electrões e aumento da taxa de glicólise na presença de concentrações normal de oxigénio (Vander Heiden et al., 2009; Warburg, 1956). Consequentemente, ao contrário da maioria das células normais, muitas células tumorais produzem quantidades substanciais da sua energia através da glicólise aeróbia, convertendo a maior parte da glucose a lactato ao invés de a metabolizarem mediante fosforilação oxidativa (Semenza, 2008; Warburg, 1956). Em suma, as células tumorais apesentam maior consumo de nutrientes e também maior produção de subprodutos do que os tecidos normais, resultando numa acumulação de metabolitos no interior da célula e na criação de um ambiente mais hostil no exterior da mesma. As alterações metabólicas e as adaptações desenvolvidas pelas células tumorais, extensivamente estudadas durante o último século, criam um fenótipo que é essencial ao crescimento tumoral e à sobrevivência da célula tumoral, alterando o fluxo ao longo de vias metabólicas chave, tais como a glicólise e a glutaminólise (Tennant et al., 2009). Estas alterações incluem a alteração da expressão (Semenza et al., 1996), mutação e inactivação pós-traducional de uma enzima (Kim et al., 2006) ou a substituição de uma enzima por uma isoforma diferente (Atsumi et al., 2002). Por outro lado, embora os factores chave envolvidos na criação do fenótipo metabólico das células tumorais estejam por elucidar, a literatura actual indica que o c-Myc, p53 o HIF-1 são cruciais neste processo e que existe uma acção combinada desta tríade de factores de transcrição na regulação do metabolismo tumoral (Yeung et al., 2008). Assim, as observações referidas anteriormente colocam a glicólise como contribuinte chave para o fenótipo maligno e suportam a procura de novos tratamentos para o cancro que têm como alvo esta via metabólica essencial. Na verdade, a maioria das adaptações metabólicas desenvolvidas pelas células tumorais são únicas e exclusivas relativamente aos tecidos saudáveis(Porporato et al., 2011). De forma a estabelecer novos alvos terapêuticos os transportadores de compostos carboxilatos, principalmente de glucose, lactato e piruvato devem ser estudados bem como as enzimas que catalisam passos chave em vias metabólicas centrais, como é o caso da lactato e da piruvato desidrogenase. A reacção reversível de redução do piruvato a lactato é catalisada pela família de enzimas lactato desidrogenases (LDH), formadas pelo rearranjo de até quatro cópias de duas subunidades diferentes: a subunidade LDH-H codificada no gene LDHB e a subunidade LDH-M codificada no gene LDHA para formar tetrâmeros activos que conduzem à formação de cinco enzimas, LDH1 a LDH5. A LDH5/LDH-4M (LDHA) catalisa preferencialmente a redução de piruvato a lactato e a LDH1/LDH-4H (LDHB) a conversão de lactato em piruvato (Porporato et al., 2011). A família de genes LDH também o gene LDHC, expresso nos testículos e espermatozóides, que codifica uma terceira isoenzima, a LDHC (Holmes & Goldberg, 2009). A reacção catalisada pela LDH5/LDH-4M produz concentrações equimolares de lactato e protões, então, de forma a evitar a acidificação intracelular e a morte, as células glicolíticas exportam protões através de sistemas adaptados ao transporte dos mesmos, em que se incluem os transportadores de monocarboxilatos (MCT), entre os quais o MCT1, MCT2, MCT3 e MCT4 efectuam o simporte passivo de lactato e protões (Halestrap & Meredith, 2004). Tem sido reportada a sobre-expressão e activação do gene LDHA no tecido tumoral comparativamente com o tecido normal (Walenta & Mueller-Klieser, 2004; Lewis et al., 2000; Shim et al., 1997). Estudos anteriores revelaram transactivação do promotor deste gene pelo factor de transcrição c-Myc (Shim et al., 1997), aumentando directamente a sua expressão. Em relação ao LDHB não foi ainda estabelecida uma relação definitiva entre a expressão deste gene e o cancro, com alguns autores a reportarem o aumento (Chen et al., 2006) da mesma no tumor e outros, o seu silenciamento transcricional no tumor (Leiblich et al., 2006; Maekawa et al., 2003). Recentemente, tem sido também identificada expressão do gene LDHC num largo espectro de tumores (Koslowski et al., 2002). Sabe-se que o MCT4 transporta preferencialmente o lactato para o exterior da célula e o MCT1 regula preferencialmente a entrada do mesmo em células tumorais (mas também o efluxo) e células endoteliais tumorais (Draoui & Feron, 2011). Existem estudos que demonstram a sobre-expressão de MCT1 em carcinoma da mama (Pinheiro et al., 2010) e outros em que se verificou a sobre-expressão de MCT1 e MCT4 em neuroblastoma, cancro do colo do útero e colorectal (Pinheiro et al., 2009; Pinheiro et al., 2008; Sonveaux et al., 2008; Fang et al., 2006). Com base no trabalho científico que vem sendo realizado na área do metabolismo tumoral, foi definido como objectivo desta tese a caracterização do perfil metabólico de duas linhas celulares de cancro de colo do útero de dois tipos histológicos diferentes, adenocarcinoma (HeLa) e carcinoma pavimento celular (SiHa), determinando a relevância das enzimas LDHA, LDHB e LDHC e dos transportadores MCT1 e MCT4. Especificamente, compreender o papel do factor de crescimento EGF e do lactato de sódio (NaLac) na regulação da expressão de LDHA, LDHB, LDHC, MCT1 e MCT4 nas linhas celulares HeLa e SiHa. Os resultados revelaram que em células HeLa, a presença de NaLac promove a sobre-expressão de LDHA através da interacção do factor de transcrição c-Myc com o promotor do gene. Nesta linha celular foi também identificada amplificação genética de c-Myc. Em células SiHa a presença de NaLac promove igualmente um aumento na expressão de LDHA, a nível do mRNA, contudo não por intermédio da acção de c-Myc. Nesta linha celular, observou-se também um aumento no número de cópias de c-Myc, porém em resultado de aneuploidia, uma vez que estas células apresentaram mais de dois cromossomas 8, onde se localiza o c-Myc. Relativamente ao gene LDHB, verificou-se que, em ambas as linhas celulares, a presença de NaLac promove a sobre-expressão do mesmo. Em relação às células SiHa observou-se ainda que a estimulação com EGF promove a expressão de LDHB sendo este efeito activador potenciado pela presença de NaLac. Em termos de regulação da expressão de LDHB propõe-se que esta seja mediada pelo factor de transcrição STAT3. No que concerne à expressão dos transportadores de monocarboxilatos, verificou-se que a expressão de MCT1 em células HeLa na presença de NaLac é regulada pelo factor de transcrição c-Myc que actuará, neste cenário, como repressor. Já no que diz respeito às células SiHa os dados apontam para a existência de repressão da expressão do gene pelo c-Myc, em condições controlo, e para a sua activação na presença de NaLac. Em termos de perspectivas futuras, a elucidação do papel do c-Myc como activador ou repressor da expressão de MCT1 dependerá do estudo dos seus parceiros nos diferentes contextos. Em relação ao MCT4, este encontra-se sobre-expresso em ambas as linhas celulares quando expostas a NaLac. Os resultados obtidos na análise de casos de AC e SCC do colo do útero evidenciaram o papel crucial do microambiente tumoral na selecção de células tumorais. No contexto oxidativo em que os tumores pavimentosos se desenvolvem, a sobre-expressão de MCT1 pode conferir vantagens às células tumorais, dada a sua importância na importação de lactato. Além disso, esta sobre-expressão pode estar na base do switch do consumo de glucose para o de lactato neste tipo de tumor, tal como foi descrito em células SiHa. Nos casos de AC, as baixas concentrações de lactato que caracterizam o microambiente tumoral dos AC, parecem promover a diminuição da expressão de MCT1. Por outro lado, se considerarmos o papel do microambiente tumoral como agente de selecção, os menores níveis de lactato podem selecionar as células tumorais que expressam menos MCT1 dada a sua menor necessidade de importar lactato, comparativamente com as células tumorais de carcinomas pavimentosos. O estudo da migração e proliferação in vitro revelou que a estimulação com EGF e a presença de NaLac promove a migração e proliferação das células SiHa. Propomos que o factor de transcrição c-Myc possa estar implicado neste fenótipo via regulação da expressão de MCT1, cuja função permite fornecer à célula tumoral fontes de energia alternativas de modo a sustentar a sua avidez energética. Assim sendo, o factor de transcrição c-Myc pode estar implicado na regulação de vários genes alvo regulando processos não só relacionados com o metabolismo mas também com o controlo do ciclo celular. O estabelecimento de modelos in vivo, nomeadamente para estudo das consequências da inibição de MCT1 a nível do crescimento e progressão tumoral surge como futura abordagem.Emerging evidence indicates that impaired cellular energy metabolism is the defining characteristic of nearly all cancers regardless their cellular or tissue origin. Tumor cells have a remarkably different metabolism from that of the tissues from which they are derived. Although lactate is generally considered a waste product, several studies show that it is a prominent substrate that fuels the oxidative metabolism of oxygenated tumor cells. The study of the enzymes involved in lactate production (LDHA) and consumption (LDHB), as well as its transporters (MCTs), will help to define new therapeutic targets. The main objective of this thesis is to characterize the metabolic profile of two uterine cervix cancer cell lines from two different histological types, adenocarcinoma (HeLa) and squamous cell carcinoma (SiHa), namely LDHs and MCTs expression regulation by sodium lactate (NaLac) and Epidermal Growth Factor (EGF). Our findings suggested c-Myc activation of LDHA expression in HeLa cells grown in the presence of NaLac. Regarding SiHa cells, it was observed LDHA upregulation, at mRNA levels, by NaLac, however not c-Myc mediated. NaLac promotes LDHB expression in both cell lines. In SiHa cells, EGF promotes LDHB expression too, being this activator effect increased by NaLac. We proposed NaLac-mediated c-Myc repression of MCT1 expression in HeLa cells. In SiHa cells, NaLac activates MCT1 expression, decreasing c-Myc interaction with MCT1 promoter or promoting an alternative role of c-Myc as an activator. NaLac also promotes MCT4 expression. In the oxidative context where SCC cancer cells develop, the upregulation of MCT1 confer crucial advantages to these cells, given its importance in lactate uptake and could be in the basis of a switch from glucose to lactate consumption in SCC tumors, as described in SiHa cells. We suggested that c-Myc could also be involved in cell migration and proliferation in vitro, via MCT1