Genetic variation and phylogeography of the wild yeast Saccharomyces paradoxus in Eurasia

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011As leveduras do género Saccharomyces, em particular S. cerevisiae, estão intimamente relacionadas com o bem-estar público das nossas sociedades. As suas contribuições são essenciais quer na área da Biotecnologia como na Medicina. Esta levedura tem vindo a estender a sua importância, estabelecendo-se como organismo modelo em diversos ramos da genética, o que se reflectiu com o primeiro genoma eucariota totalmente sequenciado. Mais recentemente, o aumento do número de isolados de ambientes naturais tem sido encarado como um avanço para a experimentação de modelos populacionais. No entanto, como S. cerevisiae está, desde há muito tempo, associada a ambientes antropogénicos, a controvérsia da sua utilização para estudos de parâmetros populacionais em populações naturais ainda persiste. Por outro lado, S. paradoxus, o parente mais próximo de S. cerevisiae, não existe em ambientes associados ao Homem e, até ao momento, só é isolado a partir de amostras naturais. Por isso, S. paradoxus tem sido apontado como o organismo modelo eucariota microbiano mais apropriado para investir em estudos de Genética Populacional e Ecologia Evolutiva. Presentemente, a espécie S. paradoxus é constituída por três grandes grupos filogenéticos, representando populações discretas e independentes, estritamente correlacionados com a geografia à escala continental: América do Norte, Europa e Extremo Oriente (Rússia de Leste e Japão). Estudos recentes têm demostrado que a divergência de sequências dentro desta espécie é função da distância geográfica, verificando-se a existência de uma relação positiva entre ambas. Esta variação ao nível de sequência está também relacionada com o isolamento reprodutor (pós-zigótico) parcial. Todos estes dados têm apontado para que estas três grandes populações de S. paradoxus possam representar uma fase precoce e em continuação de especiação alopátrica. O isolamento de Saccharomyces, mas principalmente de S. paradoxus, de ambientes naturais tem sido maioritariamente alcançado e com maiores taxas de sucesso quando se analisa o “sistema de carvalhos”, ou seja, casca, exudados ou solos destas árvores. A associação leveduracarvalhos é ainda reforçada por ambos partilharem a mesma distribuição geográfica. Actualmente, está bem documentado que a distribuição espacial dos genótipos de carvalhos foi influenciada pelo Último Período Glaciar (LGM). Com o avanço da calota de gelo, os genótipos que se encontravam latitudinalmente a Norte foram extintos, enquanto que outros sobreviveram a este avanço em regiões discretas de clima mais ameno (refúgios). No continente Europeu, estes refúgios foram associados às três regiões peninsulares mais a Sul: Ibéria, Itália e Balcãs. Aqui, estas populações de refúgio divergiram em alopatria. Com o progressivo aumento de temperatura e degelo, os genótipos divergentes expandiram-se para Norte e recolonizaram estes novos habitats, apresentando a distribuição que hoje se observa. A hipótese de trabalho proposta para este estudo foi a de que, dada a consistente associação entre o isolamento de S. paradoxus e a distribuição de carvalhos ao nível do continente Europeu, a distribuição geográfica dos genótipos desta levedura terá sofrido uma forte influência dos períodos glaciares, principalmente do LGM, uma vez que várias evidências apontam para que esta não se poderia ter mantido nestes ecossistemas. Por exemplo, não existem notícias de isolamento de S. paradoxus em biotipos de Tundra de ecossistemas permanentemente gelados. Para abordar este assunto foi seguida uma perspectiva utilizando métodos e modelos de Genética Populacional sobre um conjunto de sessenta isolados distribuídos por nove regiões da Eurásia e aplicando a genotipagem a cinco loci de microssatélites polimórficos. Os níveis estimados de diferenciação populacional sobre todas as regiões estudadas recuperaram uma forte e significativa estrutura populacional (RST = 0.289) que será o reflexo da presença de quatro clusters genéticos ancestrais no complexo Europeu de S. paradoxus. Três destes clusters genéticos distribuíram-se geograficamente e de forma segregada pelas populações das Peninsulas Ibérica e Balcãnica. Enquanto que a comparação, por análise AMOVA (Análise de Variância Molecular), entre Portugal e Grécia estruturou significativamente estas duas populações, evidenciando assinaturas genéticas de divergência em alopatria nos dois diferentes putativos refúgios, a comparação entre ambas estas populações com Espanha não foi indicativa de diferenciação. Isto indica que a população amostrada de Espanha poderá representar uma zona de contacto entre os clusters identificados nestas duas penínsulas e que não serviu de refúgio para S. paradoxus. Assim sendo, apenas regiões mais a sudoeste da Península Ibérica terão suportado a permanência e o consequente isolamento em alopatria entre as populações de Portugal e Grécia. Adicionalmente, a identificação de dois clusters em Portugal aponta para uma elevada complexidade genética, podendo propôr-se a existência de diferentes refúgios aqui nesta região, o que também tem sido descrito mais recentemente com relativa frequência para outras espécies de animais e plantas. Devido à reduzida amostragem deste estudo na Península de Itália não foi possível fazer qualquer inferência sobre o papel desta região sobre a distribuição dos genótipos de S. paradoxus na Europa. Com este trabalho foi também identificado um quarto cluster genético presente na região Este (Moscovo e Sibéria) da Eurasia. Estes indivíduos eram genotipicamente idênticos o que não se enquadra na diversidade genética dos refúgios. No entanto, a presença deste cluster aponta para a existência de um outro possível refúgio a Este para S. paradoxus que permanece ainda por identificar, sendo necessário maior amostragem nestas regiões. As regiões do centro e norte da Europa apresentaram coeficientes de ancestralidade e uma grande proporção de indivíduos mosaico relacionados com os clusters dos refúgios, o que demostra uma grande confluência dos genótipos dos refúgios nas latitudes mais a Norte. Estas evidências são compatíveis com o cenário de expansão pós-glaciar para Norte com origem nos refúgios identificados nas penínsulas do Sul. Diferentes refúgios tiveram diferente impacto na estruturação das populações resultantes da expansão. Enquanto que os genótipos originários da Península Ibérica foram mais influentes nas populações da Europa Central e Reino Unido, os genótipos com origem nos Balcãs exerceram maior influência no Norte da Europa, como evidenciado pelos elevados níveis de fluxo génico entre as duas populações (Grécia e Norte da Europa, Nem = 1.667), e também mais para Este na região do Cáspio. De forma a complementar e integrar toda esta informação numa escala temporal, os tempos de divergência calculados entre as populações dos putativos refúgios, apesar de largos e com um elevado grau de incerteza, colocam na sua maioria a divergência para o LGM ou para um período tardio do Pleistoceno. Por outro lado, a divergência entre as populações dos putativos refúgios e populações mais a norte datam para períodos posteriores ao LGM, quando a temperatura aumentou e as calotas de gelo foram derretendo, possibilitando a expansão para norte. Em concordância, a ausência de isolamento-por-distância envolvendo as populações que estarão relacionadas com a expansão dos genótipos a partir do(s) refúgio(s) identificado(s) na Península Ibérica também sugere uma origem recente para as populações do norte da Europa. Curiosamente, os padrões aqui identificados de isolamento em refúgios nas penínsulas da Ibéria e Balcãs e consequente avanço pós-glaciar para Norte são congruentes com os padrões identificados para os carvalhos, encaixando-se num paradigma já estabelecido para o isolamento seguido da recolonização das regiões norte da Europa. Assim, foi possível reforçar a hipótese de que, de facto, os carvalhos têm desempenhado um papel fundamental não só na distribuição de S. paradoxus com também na sua estruturação genética na Europa, podendo representar os sistemas mais apropriados para o desenvolvimento e fluxo da levedura na natureza. O resultado do trabalho desenvolvido durante esta dissertação revelou ser de importância primordial, abrindo novos horizontes para o escrutínio da ecologia evolutiva de S. paradoxus ou de leveduras do género Saccharomyces, no geral. Adicionalmente, dada a crescente utilização de S. paradoxus em estudos populacionais, este estudo contribui com um grande avanço para o estabelecimento definitivo desta levedura selvagem como organismo modelo nas áreas da Genética Populacional, Ecologia Evolutiva e Genética Evolutiva de populações naturais.Within the last recent years, the increasing number of Saccharomyces isolates collected from natural habitats has placed this yeast genus at the forefront of population genetic studies. In particular, S. paradoxus, the wild relative of S. cerevisiae, is setting itself as a model organism for population genetic and genomic approaches. Herein, sixty S. paradoxus isolates distributed over nine regions in Eurasia were studied to expose the partition and the structure of genetic variation within this complex. This was achieved employing a phylogeographic rationale over a set of five polymorphic microsatellite data. Estimates of population differentiation were high and reflected the presence of four ancestral genetic clusters. Populations from Portugal and Greece were assigned to geographically different clusters and had diverged in allopatric putative refugia for sufficient long time to led molecular signatures of such isolation. By contrast, northern populations were found to share varying contributions from the ancestral clusters and did not present detectable molecular departures from the refugia populations. Most of the mosaic representation was allocated to northern individuals. Both the absence of isolation by distance and divergence time estimates involving northern populations suggested that these had a relatively recent origin. On the other hand, divergence time estimates between refugial populations, although wide, mostly included the Last Glacial Maximum (LGM), or previous periods. Altogether, the scenario is compatible with southern peninsula refugia and post-glacial North advance during the late Pleistocene glaciations. In here, it was also hypothesized that the oak system may drive S. paradoxus ecology as both seem to share the same phylogeographic patterns. The work developed in this dissertation contributes to a better comprehension of the life history and ecology of the yeast S. paradoxus and puts forward a highly motivation to definitely establish this yeast as a model organism in population genetics