Clonagem e caracterização de sistemas de restrição e modificação do tipo IIG de Epsilonproteobacteria em Escherichia coli

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Os sistemas de restrição e modificação (RM) são sistemas enzimáticos não vitais, de complexidade variável, ubiquitários em Bacteria e Archaea. Actualmente considera-se que existam quatro grandes tipos e vários subtipos. Alguns dos géneros que pertencem à ordem Campylobacterales, nomeadamente Helicobacter e Campylobacter, têm uma característica pouco frequente, a presença de um elevado número de sistemas RM putativos no seu genoma. Analisaram-se os trinta e um genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie H. pylori e os nove genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie C. jejuni, anotados na REBASE (restriction enzyme database), e verificou-se que os sistemas RM não se encontram distribuídos ao acaso pelo genoma, localizando-se em loci bem definidos. A análise focou-se nos sistemas RM do tipo IIG e tendo as estirpes H. pylori 26695 e C. jejuni RM1221 como modelo, encontraram-se quatro loci em cada uma delas. Foram desenhados primers para os oito loci e usadas dezassete estirpes de H. pylori e cento e sessenta e nove estirpes de Campylobacter para verificar se essa observação era comum entre as diferentes estirpes. Obteve-se amplificação em todos os loci testados mas observaram-se grandes diferenças entre eles, após digestão com HindIII. Pôde também observar-se que nalguns dos loci testados não se obteve amplificação. Todos os produtos de PCR cujo perfil foi diferente, quer de estirpes de H. pylori, quer de estirpes de Campylobacter, foram clonados em pUC19 e transformados em Escherichia coli DH10B, mas apenas sete dos produtos de Campylobacter codificaram para uma enzima de restrição activa. É possível que em H. pylori a maioria destes genes putativos esteja inactivo, não só porque nos genomas sequenciados existem várias ORF com frameshifts, mas também porque podem ter ocorrido movimentos de sequências de DNA entre domínios situados em posições diferentes, no interior de um gene. No futuro, a sequenciação dos clones obtidos poderá permitir perceber se essa é de facto a razão para a falta de actividade observada.Restriction and modification (RM) systems are non-vital enzymatic systems of diverse complexity, which are ubiquitary among Bacteria and Archaea. Currently the RM systems are classified into four major types and several subtypes. Some of the genus which belong to order Campylobacterales, mainly Helicobacter and Campylobacter, have a remarkable characteristic, the presence of a large number of putative RM systems in their genomes. The thirty one complete sequenced H. pylori genomes were analysed as well as the nine complete sequenced C. jejuni genomes annotated in REBASE (restriction enzyme database) and it was found that the RM systems are not randomly distributed over the genome, but instead are located at specific loci. The analysis was directed to type IIG RM systems and having H. pylori 26695 and C. jejuni RM1221 as models, four loci in each of them were found. Primers for the eight loci were designed and seventeen H. pylori strains and a hundred and sixty nine Campylobacter strains were used to test if this observation was common. PCR products were obtained in all loci but large differences between them were observed after digestion with HindIII. It was also realised that some of the loci were empty. All of the different PCR products from H. pylori strains and Campylobacter strains were cloned in pUC19 and transformed in Escherichia coli DH10B, but only seven from Campylobacter showed restriction activity. In H. pylori it is possible that most of these type IIG genes are “turn off” in the majority of the strains tested, not only because in the sequenced genomes there are several ORF with frameshifts, but also because movements of sequences between domains in different positions within a protein coding gene might have occurred . We will sequence some of our clones to see if that is the reason for the lack of activity