Oxidative stress and neuroprotective effect of metabolites of Blackberry digestion using a neurodegeneration cell model

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011An increasing lifespan of the European population has become nowadays a major concern, not only in terms of health but also well being of an aged population. Neurodegenative diseases emerge as a growing and worrying health problem of the 21st century, perhaps the most disturbing one. Dietary phytochemicals have been suggested to play an important role in the prevention of degenerative diseases. They may exert beneficial effects on the central nervous system by protecting neurons against stress-induced injury, by suppressing neuroinflammation, and by improving vascular blood flow to the brain, all leading to the maintenance of cognitive function. Oxidative stress has been referred to play a crucial role in a number of diseases, including cancer and neurodegenerative disorders. Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) are highly reactive with proteins, lipids, carbohydrates and nucleic acids, leading to cellular dysfunction. The main aim of this study was to develop and optimize methods that are able to access the oxidative stress effects in biological molecules and also evaluate the neuroprotective effect of blackberry serum available metabolites in human neuroblastoma cells submitted to an oxidative injury. Thiol content, lipid peroxidation and protein carbonyl levels were the three main parameters evaluated. Techniques as HPLC, spectrophotomety, western blot analysis and flow cytometry were used in order to compare different conditions that the SK-N-MC cell line was exposed. A variable behavior of cells was observed during increasing times of exposition to stress conditions; time-course profile of the neuroblastoma cell line was crucial to evaluate possible neuroprotective effects of berries and any potential amelioration of the metabolic conditions of the cells. Further studies involving the determination of oxidative stress parameters will be crucial to have a better understanding of mechanisms underlying neurodegenerative diseases and to foresee alternatives in the prevention and fight of these diseases.O aumento da esperança média de vida da população Europeia tem-se tornado, hoje em dia, uma enorme preocupação, não somente em termos de saúde, como também em termos de bem-estar de uma população envelhecida. As doenças neurodegenerativas surgem como um crescente e preocupante problema de saúde do século XXI, talvez o mais inquietante de todos. Ao contrário de alguns fármacos recorrentes nos dias de hoje, a nutrição surge como uma nova forma de combater o problema deste tipo de doenças em estádios mais precoces de progressão. Os pequenos frutos, como as amoras, framboesas, mirtilos, surgem como potenciais alimentos funcionais na prevenção de doenças neurodegenerativas, entre outras. Os fitoquímicos provenientes da dieta têm sido implicados no desempenho de um papel importante na prevenção de doenças degenerativas. Estes podem exercer efeitos benéficos no sistema nervoso central através da protecção dos neurónios contra danos induzidos pelo stress, pela supressão de inflamação neuronal, e pela melhoria do fluxo sanguíneo para o cérebro, todos conduzindo à manutenção das capacidades cognitivas. Os pequenos frutos surgem como fontes primordiais de fitoquímicos, podendo exercer efeitos benéficos na neuroprotecção. Por outro lado, o stress oxidativo tem sido mencionado como pivot a desempenhar um papel central em várias doenças, incluindo cancro e doenças neurodegenerativas. Espécies reactivas de oxigénio e espécies reactivas de azoto são altamente reactivas com proteínas, lípidos, glúcidos, e ácidos nucleicos, conduzindo à disfunção celular. Uma vez que um aumento na formação de espécies reactivas de oxigénio surge como um mecanismo de alguma forma envolvido nas doenças neurodegenerativas, o uso de um modelo baseado na indução de stress oxidativo a neurónios pode ajudar na compreensão de mecanismos molecular subjacentes à progressão da doença. Assim, um modelo celular de neurogeneração, células SK-N-MC incubadas com peróxido de hidrogénio, foram o ponto de partida para as análises realizadas neste estudo. O objectivo principal deste trabalho consistiu no desenvolvimento e optimização de métodos que permitissem avaliar os efeitos resultantes do stress oxidativo em moléculas biológicas e também avaliar o efeito neuroprotector de metabolitos existentes nos extractos digeridos in vitro de pequenos frutos, nomeadamente de amoras, em neuroblastomas humanos submetidos a stress oxidativo. O conteúdo em tióis, peroxidação lipídica e carbonílos proteicos foram os três principais parâmetros avaliados nas células. Técnicas como HPLC, espectrofotometria, análises imunológicas como Western blot e ELISA, e citometria de fluxo foram utilizadas de modo a comparar diferentes condições experimentais às quais o modelo celular de SK-N-MC foi submetido. Um comportamento variável das células foi observado durante os crescentes tempos de exposição a condições de stress (incubação das células com peróxido de hidrogénio por diferentes períodos de tempo): observou-se uma redução do conteúdo em glutationo (forma reduzida) coincidente com o decréscimo acentuado de viabilidade. Condições de stress oxidativo conduzem à oxidação de glutationo, levando a uma diminuição de glutationo reduzido livre dentro da célula. As células SK-N-MC aparentam possuir uma certa capacidade de preservação do metabolismo celular, nas primeiras três a quatro horas de exposição ao peróxido de hidrogénio, mantendo o rácio de glutationo e os níveis de oxidação proteica. Com o aumento do período de exposição ao stress, menor a viabilidade celular e maior o conteúdo em carbonílos, sugerindo um metabolismo celular drasticamente alterado. Assim, o conhecimento do padrão temporal de resposta ao stress dos neuroblastomas foi crucial para avaliar possíveis efeitos neuroprotectores dos pequenos frutos e qualquer potencial melhoria das condições metabólicas das células. Extractos digeridos de variantes de amora comercial e selvagens (provenientes da região de Bragança) foram pré-incubados nas células, anterior à exposição destas ao stress, tendo revelado possíveis efeitos protectores na manutenção dos níveis de tióis para valores semelhantes aos observados em condições controlo. Apenas valores relativos a tióis e viabilidade celular por citometria de fluxo foram avaliados para estas condições, sendo necessária uma avaliação mais cuidada e detalhada por métodos complementares da importância destes pequenos frutos na neuroprotecção. Outros estudos envolvendo a determinação dos parâmetros de stress oxidativo pelos métodos implementados neste estudo serão fundamentais para conseguir uma melhor compreensão dos fenómenos por detrás das doenças neurodegenerativas e na pesquisa de terapias alternativas na prevenção e no combate destas doenças