Photoprotection and photoinhibition in the diatom Phaeodactylum tricornutum

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Productivity in marine environments is largely based on the photosynthetic activity of diatoms, microalgae that account for ca. 40% of global oceanic carbon fixation. High photosynthetic rates in diatoms are maintained despite the systematic exposure to changing environmental conditions. Of particular importance is the exposure to changing irradiances, including supersaturating light levels. The success of diatoms in coping with high light has been attributed to the efficiency of their photoprotective mechanisms. In this study, we investigated the effect of light stress on the reaction centre protein D1/psbA from photosystem II of Phaeodactylum tricornutum, which has been shown to be the major target of photodamage. Cultures were grown at 40 μmol photons.m-2.s-1 (used as control) and subjected to 1 h high light (HL) stress of 1,250 μmol photons.m-2.s-1. Lincomycin was added to half of the cultures to infer on PSII repair capacities, by determining D1 concentration with immunoblotting. Pulse-amplitude modulated fluorometry was used to measure stress effects on quantum yield and non-photochemical quenching (NPQ). Pigment concentrations, including the xanthophylls diadinoxanthin and diatoxanthin, were quantified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). It was observed a decrease in D1 in both light treatments, but much more pronounced in HL. Lincomycin affected D1 repair, particularly in HL where almost no D1 was detected. Quantum yield of PSII decreases after 1 h of HL, recovering almost 50%, while lincomycin treated cultures only recovered 25%. NPQ was similar in both treatments, reaching a maximum of 5.7, with diatoxanthin increasing under HL. NPQ’s energy-dependent quenching (qE) dissipated after 13-20 min, while photoinhibitory quenching (qI) was still present after 24 h of recovery. Rapid light curves (RLCs) show a decrease in α, a maintained rETRm which decreases only in lincomycin treated cultures and an increased Ek when lincomycin is added, although it is decreased after recovery. D1 degradation has a damaging effect on PSII repair and recovery, supported by the lowered quantum yields and the high NPQ. P. tricornutum therefore seems to have highly efficient photoprotective mechanisms, with photoinhibition occurring only when repair cannot keep up with the damage inflicted, which was only observed in HL.Numa altura em que as alterações climáticas se tornaram a prioridade em termos de sustentabilidade do planeta, a atenção para com organismos com particular importância para a fixação de carbono é essencial. O fitoplâncton é responsável por quase 50 % da fixação de carbono inorgânico na Terra, sendo necessária uma percepção mais aprofundada do seu papel nos ecossistemas, e o seu impacto global, que até há umas décadas atrás era ainda largamente ignorado. A produtividade nos ecossistemas marinhos é maioritariamente baseada na actividade de diatomáceas (Baccillariophyceae), microalgas que habitam todo o tipo de ambientes aquáticos, responsáveis por cerca de 40 % da fixação de carbono pelos oceanos, quase 25 % a nível global. São um grupo de organismos extremamente diverso, com cerca de 200,000 espécies descritas, e os seus cloroplastos envoltos por duas membranas, resultado de uma hipotética endossimbiose secundária, evoluindo da linhagem vermelha de cloroplastos. A sua parede celular de sílica, denominada frústula, é formada por duas partes assimétricas, daí o nome do grupo. Possuem altas taxas fotossintéticas, que são mantidas apesar da exposição sistemática a condições ambientais variáveis, sendo por isso de relevo o seu papel nos ecossistemas, como moduladores do ciclo do silício devido às suas frústulas de sílica, que também as tornam promissoras no campo da nanotecnologia, bem como a sua aplicação na indústria dos biocombustíveis, devido ao seu alto teor em lípidos, que as torna bastante promissoras para a produção de biodiesel. Relativamente às dificuldades por que passam as diatomáceas nos seus habitats, é de salientar a exposição a diferentes irradiâncias, incluindo níveis saturantes de luz. O sucesso das diatomáceas em lidar com luz elevada tem sido atribuído à eficiência dos seus mecanismos fotoprotectores. Os organismos fotossintéticos têm também mecanismos de reparação quando os seus aparelhos fotossintéticos são danificados. No entanto, se os danos infligidos por um qualquer tipo de stresse forem demasiado fortes, de modo que a reparação não acompanhe, ou seja mesmo inibida, ocorre inibição da fotossíntese. Esta, caso seja provocada pelo excesso de luz, designa-se de fotoinibição. O excesso de luz reflecte-se na degradação de proteínas que constituem o fotossistema II (PSII), principalmente da proteína D1/psbA, que é desfosforilada e degradada pela protease FtsH nas membranas tilacoidais em contacto com o estroma dos cloroplastos. A fotoinibição pode provir do lado dos dadores ou aceitadores de electrões (e-), em que vários constituintes ou envolventes do PSII provocam danos directos nos constituintes do PSII, ou produzem intermediários responsáveis pela formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), que vão actuar principalmente na reparação de proteínas, por inibição da sua tradução. Para tal os organismos desenvolveram mecanismos para se protegerem destes fenómenos prejudiciais, produzindo anti-oxidantes como a superóxido dismutase, peroxidase ou o α-tocoferol, e pigmentos que dissipam a energia em excesso, como carotenóides, dos quais se salientam as xantofilas, cujo mecanismo de de-epoxidação produz pigmentos extremamente poderosos na dissipação de energia na forma de calor, o chamado quenching não-fotoquímico (NPQ). Neste estudo investigámos o efeito de stress luminoso na proteína D1/PsbA, pertencente ao centro de reacção do PSII, em Phaeodactylum tricornutum, proteína que está provada ser o alvo principal de danos causados pela luz. Para tal, fizeram-se crescer culturas a 40 μmol fotões.m-2.s-1 (usadas como controlo) e algumas foram sujeitadas a 1 h de stress de luz alta a 1,250 μmol fotões.m-2.s-1. Um inibidor da síntese de proteínas de cloroplastos, lincomicina, foi adicionado a metade das culturas de cada tratamento, para determinar a capacidade de reparação da proteína e o efeito na actividade fotossintética. Determinou-se a concentração de D1 com recurso a western immunoblotting, utilizando-se anticorpos anti-psbA e um anticorpo secundário conjugado com horse-radish peroxidase (HRP), concretizando-se a quantificação absoluta calibrando com proteína D1 purificada. A fluorometria de Pulso Modulado (PAM) foi usada para determinar o rendimento quântico do fotossistema II antes, durante e após irradiância com luz alta, e após 24 h de recuperação no escuro, e ainda os mecanismos de fotoprotecção. Esta técnica baseia-se na emissão de fluorescência pela clorofila a, um modo de dissipação de energia quando esta não é transformada em energia fotoquímica, ou seja, quando os fotões que são absorvidos pela clorofila não induzem a doação de um electrão ao primeiro aceitador de e-, a feofitina (Pheo), passando pela TyrZ+. Nestas situações os centros de reacção dizem-se fechados e a energia dos fotões é reemitida como fluorescência, ou como calor (NPQ). Foram ainda efectuadas curvas rápidas de luz (RLC) para se obter a eficiência fotossintética (α), o transporte máximo de electrões relativo (rETRm) e o coeficiente de saturação de luz, isto é, a luz a que o ETR é máximo (Ek). As concentrações de pigmentos, incluindo das xantofilas diadinoxantina (DD) e diatoxantina (DT), foram determinadas através de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Pretendia-se confirmar a de-epoxidação de DD em DT pela enzima DD de-epoxidase, verificar diferenças significativas entre estes dois pigmentos, e possíveis alterações no teor de clorofila a ou dos outros pigmentos, como a fucoxantina e a clorofila c, e a concentração de β-caroteno, também responsável pela dissipação de energia em excesso. Observou-se uma diminuição em D1 em todos os tratamentos, mas muito mais pronunciada em luz alta. A lincomicina afectou a reparação de D1, particularmente em luz alta onde quase não se detectou D1. O rendimento quântico do PSII obtido durante a incidência de luz alta foi praticamente nulo, e 24 h após se desligar a luz alta, recuperou quase 50 %, enquanto as culturas com lincomicina apenas recuperaram 25 %. O NPQ foi semelhante em ambos os tratamentos, atingindo um máximo de 5.7, com a diatoxantina a aumentar durante a incidência de luz alta, diminuindo após as culturas serem de novo colocadas no escuro. Todos os outros pigmentos mantiveram-se constantes em todos os tratamentos. Um dos componentes do NPQ, o quenching dependente de energia (qE), dissipou-se após 13-20 min, enquanto o quenching fotoinibitório (qI) observou-se ainda após 24 h de recuperação no escuro. As RLCs sugerem um decréscimo na eficiência da fotossíntese após a recuperação, mas uma manutenção do rETRm, que decresce apenas nas culturas tratadas com lincomicina. Inesperadamente, o Ek aumentou 40 min apó se adicionar lincomicina, antes de se irradiar as culturas com luz alta, embora decresça após a recuperação do stress. Os resultados obtidos sugerem que os elevados níveis de degradação de D1, particularmente em HL, têm um efeito destrutivo na reparação e recuperação do fotossistema II, comprovado pela diminuição do rendimento quântico após irradiação com luz alta e pelo elevado NPQ possibilitado pela conversão e síntese de novo de diatoxantina, que dissipa a energia dos centros de reacção saturados de luz. P. tricornutum parece, por tudo isto, ter mecanismos protectores muito eficientes, e apesar de ocorrer fotoinibição, isto é, danos irreversíveis, estes só ocorrem quando a reparação do fotossistema II, nomeadamente da proteína D1, não é efectuada ao mesmo ritmo que os danos causados, o que só foi observado em condições de luz alta. Sendo assim, embora ocorra fotoinibição quando irradiados 1,250 μmol fotões.m-2.s-1, a reparação do PSII resulta numa eficiente capacidade de recuperação por parte desta diatomácea. Em trabalhos posteriores seria interessante medir o teor em ROS, para determinar influência do stress oxidativo, bem como apoiar o estudo com a análise também ao nível dos transcritos, quer seja de transcritos da D1, como de outras proteínas do PSII como a D2 ou a CP43, que embora não à mesma escala, também se sabe serem bastante degradadas em algumas diatomáceas