Role of fibronectin in tumor development and progression

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A tumorigénese é um processo complexo cujas várias fases reflectem alterações genéticas que resultam na transformação progressiva de células normais em células malignas (Hanahan & Weinberg, 2000; Renan, 1993). As principais características que ditam colectivamente o cancro são: auto-suficiência em relação aos sinais de crescimento, insensibilidade aos sinais de anti-crescimento, evasão à apoptose, elevado potencial replicativo, angiogénese sustentada, evasão ao controlo imunitário, reprogramação metabólica, invasão tecidular e metastização, representando esta última a principal causa de morbidez e morte associadas à doença (Hanahan & Weinberg, 2011). Todos estes atributos resultam de uma interacção dinâmica entre as células tumorais e o seu microambiente – microambiente tumoral –, que inclui células normais, factores mediadores e componentes da matriz extracelular (MEC) (Tlsty & Coussens, 2006). A fibronectina (FN) é uma glicoproteína modular de elevado peso molecular que pode ser classificada, de acordo com a sua solubilidade, em FN plasmática, solúvel, e FN celular, uma forma menos solúvel que representa o maior componente da MEC (Klein et al, 2004; Pankov & Yamada, 2002). Estruturalmente, a FN apresenta-se sob a forma de um dímero composto por duas cadeias polipeptídicas aproximadamente idênticas, ligadas covalentemente por um par de pontes dissulfito próximo da extremidade C-terminal. Cada monómero tem um peso molecular de 230-250 kDa e é composto por três tipos de unidades de repetição ou módulos: o tipo I (FI), o tipo II (FII) e o tipo III (FIII) (Hynes & Yamada, 1982; Pankov & Yamada, 2002; Potts & Campbell, 1996). A FN, que tem como receptores integrinas, está implicada numa grande variedade de funções celulares, sobretudo envolvendo interacções entre as células e a MEC, onde assume grande importância na adesão, morfologia, migração, crescimento e diferenciação celulares, organização do citosqueleto e hemostasia (Hynes & Yamada, 1982; Kornblihtt et al, 1996; Labat-Robert, 2002). As interacções célula-célula e célula-matriz são essenciais para o fornecimento de informações que regulam o normal funcionamento celular, pelo que a degradação ou activação das proteínas de matriz e/ou da superfície celular podem mediar alterações irreversíveis no microambiente celular (Werb, 1997). O crescimento tumoral, angiogénese, invasão e metastização estão fortemente dependentes da natureza permissiva do microambiente. Durante estas fases, a proteólise da MEC representa um passo crucial (Chambers & Matrisian, 1997; Polette et al, 2004), sendo reconhecida à FN uma forte susceptibilidade neste âmbito (Kenny et al, 2008). As metaloproteases de matriz (MPMs) constituem a família de proteases mais importante associada à tumorigénese (Kessenbrock et al, 2010). As MPM-9 e MPM-2 têm sido apontadas como as MPMs mais importantes na metastização (Coussens et al, 2002; Klein et al, 2004; Malemud, 2006; Stetler-Stevenson, 1999). O aumento concomitante de FN e enzimas proteolíticas, bem como de fragmentos de fibronectina tem sido observado em doentes de cancro (Katayama et al, 1993; Kenny et al, 2008; Kenny & Lengyel, 2009; Labat-Robert, 2002; Labat-Robert et al, 1980; Warawdekar et al, 2006), sugerindo uma possível intervenção da FN e seus fragmentos no processo tumoral, embora o eventual mecanismo subjacente ao fenómeno não seja ainda claro. Paralelamente, outros estudos têm atribuído propriedades anti-tumorais a alguns fragmentos derivados da FN (Humphries et al, 1986; Humphries et al, 1988; Kato et al, 2002; Saiki, 1997; Yi & Ruoslahti, 2001). Com base no trabalho científico que vem sendo dedicado a esta temática, foi estabelecido como objectivo deste trabalho o estudo do papel da FN no desenvolvimento e progressão tumorais. Com este intuito, foi desenvolvido um trabalho experimental que partiu do estabelecimento de dois grupos, para diferentes linhas celulares, diferindo entre si nos níveis de FN produzida. Para isso, procedeu-se à construção de um plasmídeo contendo o gene da FN embrionária (full-length), pcDNA3-flFN. Este vector foi transfectado em células das linhas celulares tumorais humanas HCT15 (carcinoma colorrectal) e HeLa (adenocarcinoma do colo do útero), e da linha celular não-tumoral CHO, uma linha celular transformada onde o mecanismo de controlo de transcrição se encontra inactivado, tendo sido, por isso, utilizada como controlo positivo, in vitro. Para cada linha celular foi mantido um grupo de células controlo, não transfectadas. O trabalho experimental consistiu no desenvolvimento de ensaios in vitro e in vivo, após a indução da formação de tumores xenógrafos em modelos ortotópicos de ratinhos BALB/c-SCID. Os resultados foram comparados entre grupos. Após transfecção estável das linhas celulares, a expressão de FN foi determinada, para cada grupo, por PCR quantitativo em tempo-real. A detecção de níveis mais elevados de mRNA nos grupos controlo, para todas as linhas celulares – sobretudo em HCT15 e CHO –, validou o sucesso da transfecção, o que permitiu a progressão do trabalho experimental. Análises de western blotting – foram utilizadas como amostras a FN imunoprecipitada a partir do meio de cultura das células – e imunofluorescência confirmaram a existência de uma correlação entre níveis de mRNA e proteína, evidenciando valores proteicos de FN aumentados nos grupos transfectados, em comparação com os grupos controlo. Os resultados obtidos por western blotting mostraram, adicionalmente, a presença de fragmentos proteolíticos de FN nas linhas tumorais, não observada no controlo positivo (FN imunoprecipitada a partir de soro de um individuo saudável), o que está de acordo com as observações de vários estudos realizados em doentes de cancro (Katayama et al, 1993; Kenny et al, 2008; Kenny & Lengyel, 2009; Labat-Robert, 2002; Labat-Robert et al, 1980; Warawdekar et al, 2006). Para as linhas celulares CHO e HCT15, foram detectados níveis mais elevados de fragmentos proteolíticos de FN nos grupos transfectados, o que está de acordo com o esperado, dada a maior concentração de FN nestes grupos. Por imunofluorescência, foi observada, globalmente, uma maior expressão de integrinas nas células transfectadas, resultado esperado sendo essas os receptores da FN. Por zimografia, foi avaliada a actividade das MPMs. Foi detectada actividade proteolítica das MPM-9 e MPM-2, consideradas as MPMs mais importantes no processo de metastização (Coussens et al, 2002; Klein et al, 2004; Malemud, 2006; Stetler-Stevenson, 1999). Para a MPM-9 foi observada uma actividade proteolítica aumentada nos grupos transfectados de HCT15 e CHO, assim como para a MPM-2 em HCT15. Estes resultados podem estar relacionados com a maior concentração de FN nos meios de cultura das células transfectadas e revelaram-se também consistentes com o padrão de fragmentos de FN obtido por western blotting. O estudo da migração celular foi abordado por wound healing assay, do qual resultaram taxas de migração direccional mais elevadas para as células CHO e HCT15 transfectadas, facto que poderá estar relacionado com os resultados obtidos na zimografia. Um eventual envolvimento da FN na angiogénese foi avaliado por tube formation assay com HUVEC (células endoteliais de cordão umbilical humano) e pela quantificação da expressão, a nível de mRNA, de três isoformas de VEGF (factor de crescimento do endotélio vascular), receptores do VEGF e angiopoietinas. Os resultados mostraram uma relação inversa entre os níveis de FN e a formação de tubos. Colectivamente, os resultados in vitro sugeriram uma correlação entre níveis mais elevados de FN e um comportamento mais agressivo por parte das células, num contexto neoplásico, sugerindo um particular envolvimento da migração das células tumorais. Após aproximadamente dois meses da indução da formação de tumores nos modelos BALB/c-SCID, os animais foram sacrificados e procedeu-se à colheita dos principais órgão-alvo de metastização. A análise histológica dos tumores e órgãos recolhidos revelou mais invasão e metastização nos grupos inoculados com células controlo. Estas observações foram confirmadas para o grupo inoculado com HCT15, pela detecção de mais mastócitos nos tumores, os quais estão implicados no crescimento tumoral e invasão (Strouch et al, 2010), e pela quantificação da expressão de SCF (factor de células estaminais) – citocina envolvida na promoção da sobrevivência, proliferação e migração de mastócitos e células progenitoras (Broudy, 1997) – e SDF-1 (factor derivado do estroma da medula óssea) – citocina associada ao crescimento tumoral, angiogénese, metastização e recrutamento de células derivadas da medula óssea (Kryczek et al, 2007) –, que se revelou menor nas células transfectadas. Os resultados in vivo evidenciam, deste modo, um processo tumorigénico menos avançado nos animais inoculados com células transfectadas, contrariando as observações in vitro. Com efeito, uma taxa migratória mais elevada não implica necessariamente uma maior actividade invasiva por parte das céluals tumorais, a principal responsável pela disseminação do cancro. Por outro lado, as condições in vitro não incluem muitas variáveis existentes in vivo. Recomenda-se, no entanto, a validação dos modelos in vivo sob condições técnicas mais apropriadas. Não obstante, parece relevante a sequenciação de um fragmento detectado, para posterior investigação.Reciprocal interactions among normal cells, their mediators, components of the extracellular matrix (ECM) and genetically altered cells regulate all aspects of tumorigenicity. Fibronectin (FN), a multidomain glycoprotein, represents the major component of ECM and is implicated in a variety of cell functions, particularly those involving interactions between cells and ECM. ECM proteolysis is a crucial step during cancer stages and FN strong susceptibility to proteolytic degradation is well documented. Indeed, several studies have related FN levels to tumor progression in cancer patients, observing an increase of both FN and FN fragments levels. In parallel, some research has, on the other hand, provided evidence of protective roles of fragments derived from FN. Based on the literature that has been dedicated to the subject, it was established as objective of this work the study of the role of FN in tumor development and progression. For this purpose, an experimental work was developed arising from the establishment of two groups within each cell line used – tumor cell lines HCT15 and HeLa, and CHO –, differing in the levels of FN produced. In vitro and in vivo assays were performed and the results compared between groups. Our findings suggested a correlation between higher FN levels and a more aggressive behavior of cells in a neoplastic context, in vitro. In vivo, the opposite was observed. It is recommended, however, the validation of the in vivo models under improved technical conditions. Nevertheless, the sequence of a fragment detected appeared to be relevant for further investigation