Regulação da saída de mitose em células humanas: a função de hsMob1

Tese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Uma divisão celular bem sucedida depende da coordenação precisa entre a saída de mitose e o início da citocinese. A saída de mitose é um processo regulado, que na levedura Saccharomyces cerevisiae é despoletado por uma via de sinalização designada via de saída de mitose (MEN). Embora sejam conhecidos homólogos dos componentes da MEN, em eucariotas superiores, está ainda por estabelecer uma via idêntica que conduza à saída de mitose. A proteína reguladora de cinases Mob1, de S. cerevisiae, participa na MEN e encontra-se conservada em vários organismos. Em humanos existem 7 proteínas do tipo Mob1, das quais ainda pouco se sabe. Na pesquisa por funções relacionadas com a saída de mitose, em células humanas, dedicámos o nosso estudo à proteína hsMob1, com o objectivo de determinar a sua distribuição intracelular ao longo do ciclo e as suas funções mitóticas. A aplicação directa de técnicas de imunofluorescência a células HeLa, ou indirecta pela expressão de uma proteína recombinante com um tag de GFP, não permitiu determinar a localização precisa de hsMob1. Contudo, há um pico de expressão da proteína recombinante na fase M, o que sugere uma função específica de hsMob1, nesta fase do ciclo. A realização de RNAi de hsMob1 deu origem a cromossomas desalinhados da placa metafásica e micronúcleos em telofase e citocinese, fenótipos característicos de proteínas componentes do cinetocóro e/ou envolvidas na activação do ponto-de-controlo SAC. Demonstrou-se também que a diminuição dos níveis de hsMob1 diminui o número de células HeLa em cultura, provavelmente por indução da sua morte. Estes resultados sugerem uma participação da proteína na segregação cromossómica e na execução da citocinese, colocando-a no centro de acção do processo de saída de mitose. Além disso, pretendeuse determinar a existência de interacções de hsMob1 com a cinase Aurora B, pelo seu envolvimento nos processos celulares afectados pela depleção de hsMob1. Não se observaram alterações na localização desta cinase por RNAi de hsMob1, ficando no entanto por determinar se a sua actividade permanece inalterada nesta situação. Este estudo revela a participação de hsMob1 em processos celulares conducentes à saída de mitose e essenciais à propagação correcta da informação genética ao longo das gerações. Os resultados obtidos sugerem a existência de interacções com proteínas cinases, como Mps1, mas que permanecem por determinar.A succesfull cell division depends on precise coordination between mitotic exit and the onset of cytokinesis. In Saccharomyces cerevisiae the mitotic exit is a highly regulated process triggered by a signaling pathway, the mitotic exit network (MEN). Even though the MEN's components have homologs in higher eukaryotes, an identical pathway leading to exit from mitosis is still to be established. The S. cerevisiae Mob1 kinase regulator is a MEN component highly conserved among several organisms. In humans there are 7 Mob1 like proteins, but very few is known about each one of them. We have dedicated our study to hsMob1 protein, in human cells, aiming to determine its intracellular distribuition throughout the cell cycle and its mitotic functions. Through immunofluorescence in HeLa cells and recombinant protein expression with a GFP tag, I wasn't able to determine the precise localization of the hsMob1 protein. However, a specific mitotic function for this protein is suggested by the observation of an expression peak of the recombinant protein during M phase. hsMob1 RNAi resulted in misaligned chromosomes and micronuclei in telophase and cytokinesis, which are characteristic phenotypes of kinetochore proteins and/or proteins involved in checkpoint activation. I have demonstrated that the downregulation of hsMob1 leads to a decrease of cultured HeLa cells, likely through apoptosis. These results suggest an involvement of hsMob1 in chromosome segregation and cytokinesis execution, placing it in the centre of the mitotic exit. Furthermore, the involvement of Aurora B kinase in the cellular functions afected by downregulation of hsMob1 led us to determine the existence of interactions between these two proteins. Though no mislocalization of Aurora B was observed after hsMob1 RNAi it remains to be determined if its activity is altered in this situation. The study presented here reveals hsMob1 participation in cellular functions leading to exit from mitosis and essential for the correct transmition of genetic information throughout generations. The results obtained further suggest interactions of hsMob1 with protein kinases such as Mps1, which are still to determine