Aspectos fisiológicos da insulina e seu receptor em neurónios do hipocampo

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010O papel da insulina e do seu receptor (InsR) no cérebro é ainda obscuro conhecendo-se contudo funções importantes na aprendizagem e na memória; aponta-se também para uma associação entre doença de Alzheimer (DA) e a Diabetes. Sabe-se igualmente que a insulina controla a neuroexcitabilidade em neurónios específicos. No nosso laboratório demonstrou-se que a insulina inibe a componente lenta- Islow das correntes de K+ activadas-por-voltagem em neurónios piramidais da zona CA1 do hipocampo de ratos. Tal efeito é observado unicamente em neurónios provenientes de animais em período pós-prandial (e não em jejum). Este trabalho propõe (a) identificar o canal de K+ sensível à insulina nestes neurónios; (b) investigar os fenómenos fisiológicos subjacentes à referida diferença observada entre" preparações em jejum" e "em pós-prandial". Recorreu-se à técnica whole-cell voltage-clamp e a técnicas de western-blotting e imunocitoquímica com anticorpos contra InsR e o canal de K+ candidato. Registos de corrente revelaram que a Margatoxina (bloqueador especifico de canais K+ tipo-KV1.3) inibe também especificamente Islow (EC50=125 pM), alterando a dependência da activação à voltagem. Experiências com tratamentos articulados de insulina e várias concentrações de margatoxina indicam o canal Kv1.3 como o responsável pelo efeito da insulina nos neurónios CA1. Demonstrou-se, por electrofisiologia e por western-blot, que a expressão do InsR é maior no período de pós-prandial. Mostra-se ainda que o canal Kv1.3 é mais expresso em ―hipocampos em pós-prandial‖ e assim postula-se uma oscilação na expressão do InsR e do canal Kv1.3 durante o ciclo jejum/pós-prandial. Finalmente, usando amostras de cérebro de ratos-modelo obesos (OZR) e diabéticos (ZDF), verificou-se que a expressão do InsR nestes dois é inferior à do controlo, o que atribui protagonismo ao cérebro no contexto das diabetes. Assim, a insulina- neural controla a neuroactividade num processo dependente do ciclo alimentar. Questiona-se consequentemente a ideia do cérebro como uma entidade isolada dos ciclos metabólicos.The role of insulin and its receptor (InsR) in the brain is still poorly understood; yet some important functions in learning and memory are known. There is evidence of a relationship between Alzheimer‘s disease (DA) and Diabetes and also, that insulin controls the neuroexcitability in specific neurons. In our laboratory, it was demonstrated that insulin inhibits the slow component- Islow of voltage-dependent K+ currents in CA1 isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. This effect was only observed in neurons from fed but not fasted animal. The major aims of this work were: (a) identify the insulin sensitive K+ channel; (b) investigate physiological phenomena correlated with the observed difference between ―fasted and fed preparations‖. A combination of approaches was used: whole-cell voltage-clamp recordings and western-blotting and immunocitochemistry techniques with antibodies against the InsR and the K+ channel-candidate. Current recordings revealed that margatoxin (selective blocker of Kv1.3 K+ channels), like insulin, inhibits Islow specifically (IC50=125pM) by shifting the voltage-dependence of activation. Experiments with insulin in pretreated neurons with different margatoxin concentrations, reveal that Kv1.3 is responsible for the insulin effect in CA1 neurons. Using electrophysiology and western-blotting techniques, it was demonstrated that InsR expression is higher in fed animals. Similarly, it was shown that the Kv1.3 channel is over expressed in fed animals. Therefore, there are oscillations in the expression patterns of InsR and Kv1.3 during the ―fast-feeding‖ cycle. Finally, by using brain samples of obese (OZR) and diabetic (ZDF) rat models, a lower InsR expression in comparison to control was revealed, attributing a major role of the brain in diabetes. In short, neural insulin controls neuroactivity in a process depending on the feeding-cycle, which questions somehow the general idea of the brain as isolated from the metabolic cycles and oscillations