Dynamics of cell-extracellular matrix interactions during epaxial muscle morphogenesis

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento).Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011All muscle cells of the trunk and limbs are derived from the delamination of myogenic precursor cells (MPCs) from the dermomyotome of somites. Myogenic differentiation is then activated and orchestrated by myogenic regulatory factors. In the trunk, myogenesis begins with the formation of the myotome, a segmented muscle which progressively differentiates, reorganizes and translocates to form the definitive adult skeletal muscles. Nevertheless, external factors such as the extracellular matrix (ECM) are also important in myogenesis. Previous studies have proved that ECM plays important functions in primary myogenesis. It is thought that the fibronectin matrix may help muscle cell reorganization through its integrin receptors, in particular through α4, α5 and αv subunits. Here we mapped the 3D distribution of the fibronectin matrix in embryos throughout myotome development until its final reorganization. We also described thedistribution pattern of the αv integrin subunit. To assess the effect of fibronectin during the translocation of myocytes, we performed explant cultures, using the 70kDa fragment and the RGD peptide to inhibit fibronectin matrix assembly and cell-ECM interactions, respectively. Our data highlights a very dynamic behavior of fibronectin matrix in myogenesis. Fibronectin seems to be used as a guide by the MPCs entering the myotome from the central dermomyotome. αv subunit is present in all elongated myocytes and enriched at their tips, showing that myocytes are able to attach to the thick fibronectin matrix at intersegmental borders, possibly serving as a tendon structure. Disruption of fibronectin assembly induces the collapse of the elongated muscle cells and disruption of the myogenic program. Similarly, inhibiting cell-ECM interactions does not perturb muscle morphology, but affects myogenic differentiation. Together, these observations highlight the importance of fibronectin during muscle development, including skeletal muscle morphogenesis. All muscle cells of the trunk and limbs are derived from the delamination of myogenic precursor cells (MPCs) from the dermomyotome of somites. Myogenic differentiation is then activated and orchestrated by myogenic regulatory factors. In the trunk, myogenesis begins with the formation of the myotome, a segmented muscle which progressively differentiates, reorganizes and translocates to form the definitive adult skeletal muscles. Nevertheless, external factors such as the extracellular matrix (ECM) are also important in myogenesis. Previous studies have proved that ECM plays important functions in primary myogenesis. It is thought that the fibronectin matrix may help muscle cell reorganization through its integrin receptors, in particular through α4, α5 and αv subunits. Here we mapped the 3D distribution of the fibronectin matrix in embryos throughout myotome development until its final reorganization. We also described thedistribution pattern of the αv integrin subunit. To assess the effect of fibronectin during the translocation of myocytes, we performed explant cultures, using the 70kDa fragment and the RGD peptide to inhibit fibronectin matrix assembly and cell-ECM interactions, respectively. Our data highlights a very dynamic behavior of fibronectin matrix in myogenesis. Fibronectin seems to be used as a guide by the MPCs entering the myotome from the central dermomyotome. αv subunit is present in all elongated myocytes and enriched at their tips, showing that myocytes are able to attach to the thick fibronectin matrix at intersegmental borders, possibly serving as a tendon structure. Disruption of fibronectin assembly induces the collapse of the elongated muscle cells and disruption of the myogenic program. Similarly, inhibiting cell-ECM interactions does not perturb muscle morphology, but affects myogenic differentiation. Together, these observations highlight the importance of fibronectin during muscle development, including skeletal muscle morphogenesis.A morfogénese dos músculos esqueléticos é um processo complexo que se inicia no embrião e se prolonga por toda a vida do indivíduo, envolvendo um conjunto de factores celulares autónomos e extrínsecos, bem como a diferenciação e maturação de vários tipos de precursores celulares. Os músculos esqueléticos dos vertebrados derivam da segmentação da mesoderme paraxial, alinhada lateralmente pelo tubo neural e notocorda, estendendo-se ao longo do eixo embrionário e medialmente localizada em relação à mesoderme intermédia e lateral. Este processo conhecido por miogénese, encontra-se bem estudado em ratinho iniciando-se com a formação do miótomo, ao fim de 8,5 dias de gestação. A formação progressiva e faseada do miótomo ocorre a partir da delaminação coordenada das células progenitoras miogénicas (CPMs), que simultaneamente expressam os factores de transcrição Pax3 e Pax7. Actuando a montante e em sincronia com estes factores, são activadas uma pleutropia de vias de sinalização em resposta a factores extrínsecos às células, provenientes dos tecidos adjacentes, que regulam o início do desenvolvimento miogénico. Assim, o crescimento do miótomo dá-se por vagas sucessivas e sincronizadas de CPMs provenientes do dermomiótomo. No miótomo, as CPMs podem diferenciar-se em mioblastos, através da activação de uma cascata de factores de regulação miogénica (FRMs) ou continuam a proliferar dentro das massas musculares, constituindo um nicho residente de células progenitoras, essencial para o crescimento e desenvolvimento dos músculos. Em ratinho a hierarquia de expressão dos vários FRMs encontra-se bem estudada. Myf5 e MyoD são os primeiros factores responsáveis pela especificação das células miogénicas e Mrf4 e miogenina controlam a manutenção das populações miogénicas, actuando na fase final do programa de especificação miogénico. Após acção dos FRMs, as células miogénicas começam a expressar proteínas estruturais musculares, como a desmina e miosina. Nesta fase, no miótomo, os mioblastos diferenciam-se em miócitos que se extendem paralelamente ao longo de toda a porção do miótomo até às fronteiras que delimitam o segmento. Estes continuam a diferenciar-se, fundindo-se entre si atingindo sucessivamente a maturação, originando as massas musculares multinucleadas. A partir de um determinado estádio de E11.5/E12.5, as massas musculares epaxiais sofrem uma reorganização estrutural, alterando a sua orientação em relação ao eixoembrionário, mudando para os seus destinos finais de diferenciação. Este processo, designado por translocação muscular define a natureza transitória do miótomo, que acaba por desaparecer, formando os precursores das massas musculares adultas. Assim, a sequência de todo o programa miogénico pode ser definida como uma entidade complexa dependente da regulação e activação de factores intracelulares. Todavia, tal entidade também se baseia em processos de comunicação intercelular e interacções entre as células e o meio ambiente, onde se sabe que a matriz extracelular (MEC) representa um papel importante no desenvolvimento. Tal importância deve-se à grande versatilidade funcional da matriz, podendo actuar como suporte físico-mecânico para as células ou reter sinais bioquímicos. A MEC é constituída por uma rede dinâmica e variada de macromoléculas, maioritariamente definida por glicoproteínas, proteoglicanos e colagénios. A fibronectina é uma das glicoproteínas mais comuns da matriz intersticial. A sua montagem é controlada pelas próprias células que secretam dímeros de fibronectina, que se ligam às superfícies celulares dessas células ou outras adjacentes através de receptores membranares específicos, designados por integrinas, unindo-se ente si, formando uma rede fibrilar complexa e compacta de fibronectina. Estudos anteriores realçam a importância da fibronectina na somitogénese dos vertebrados, assim como na diferenciação miogénica de linhas celulares in vitro. As integrinas são heterodímeros transmembranares, constituídos pela combinação múltipla de uma subunidade α e outra β, sendo um dos principais elos de ligação entre as células e a MEC, através do motivo de ligação RGD. A combinação de cada subunidade perfaz um total de 24 integrinas funcionais com diferente especificidade. As integrinas α4β1, α5β1 e as de subunidade αv, destacam-se por serem receptores da fibronectina e por se saber que são expressas durante a miogénese. Pretendemos, determinar de que modo a matriz e as suas interacções com as células influenciam o desenvolvimento miogénico, afectando a diferenciação, migração e o comportamento das células miogénicas. Numa primeira fase, tentámos entender a organização da fibronectina durante o desenvolvimento muscular, desde a formação do miótomo até à fase de translocação, através de experiências de imunofluorescência in toto em embriões e reconstruções 3D. Em estádios precoces, a fibronectina surge em abundância a delimitar as fronteiras intersomíticas, assim como todos os sómitos. Mais tarde notámos que pequenos feixes de fibronectina se propagam para o interior do miótomo, adquirindo a mesma orientação dos miótcitos e crescendo em complexidade à medida que as massas musculares se desenvolvem. Em estádios miogénicos tardios observámos que a fibronectina ocupa totalmente o espaço deixado pelo dermomiótomo, após a dissociação deste e que continua presente à volta das massas musculares. Precedentemente à dissociação do dermomiótomo, notámos a formação de pequenos feixes de fibronectina na parte lateral do miótomo, isto é, entre o dermomiótomo e o miótomo, atentando uma possível interacção entre as CPMs do dermomiótomo e a fibronectina. Para averiguar esta questão, realizámos experiências de imunofluorescência, em cortes de embriões, onde observamos a presença de feixes fibrilares a envolver as CPMs em translocação. Além dessas experiências, também recorremos à técnica de imunofluorescência para detectar a integrina αv. Verificamos que, durante todas as fases em estudo está presente nos miócitos alongados, sendo especialmente enriquecida nas pontas dos mesmos, possivelmente promovendo o seu ancoramento à matriz de fibronectina. Em conjunto, os dados apontam para a possibilidade de um papel altamente dinâmico da fibronectina na morfogénese do músculo epaxial, tal como permitir a entrada das CPMs no miótomo, conferindo, mais tarde, suporte as células miogénicas para promover a sua diferenciação, alinhamento, maturação reorganização e eventual migração. Numa fase posterior, decidimos averiguar a influência que a MEC tem no comportamento das células durante a translocação do miótomo. Mais concretamente pretendemos caracterizar a forma como a MEC, em particular como a ligação à fibronectina condiciona o desenrolar da miogénese. Para tal, realizámos culturas de explantes onde os mesmos foram sujeitos à acção de um fragmento amino terminal de fibronectina de 70kDa e um péptido com o motivo RGD, que respectivamente, bloqueiam a fibrilogénese da fibronectina e as ligações às integrinas que contêm este domínio de ligação à fibronectina, onde se seguiu a imunofluorescência in toto dos referidos explantes e reconstruções 3D. Notoriamente, obtivemos um efeito significativo no fenótipo das massas musculares, uma vez que estas se apresentavam colapsadas e os miócitos encurtados, sugerindo uma interrupção drástica no desenvolvimento das mesmas. Além disso, nestes explantes também se destacou a ausência da matriz de tenascina e de células miogenina-positivas, salientando a falta de suporte estrutural das células miogénicas e a inibição do respectivo programa de diferenciação. Quando incubados com o péptido RGD, os explantes apresentavam uma morfologia muscular normal, com presença de uma matriz de tenascina. Contudo, não identificamos quaisquer células positivas para miogenina, de entre os explantes analisados, sugerindo que a inibição da ligação à matriz via RGD não afecta significativamente o desenvolvimento dos músculos esquéleticos mas é suficiente para induzir uma interrupção no programa de diferenciação miogénico. Neste trabalho evidenciamos a existência de relações directas entre as células miogénicas com a matriz de fibronectina envolvente, essenciais ao seu próprio desenvolvimento, atentando para as funções de suporte estrutural que a esta desempenha. Mais ainda, revelamos que a matriz de fibronectina é essencial para a morfogénese dos músculos esqueléticos