Study of the underlying basis for valproate hepatotoxicity : drug metabolism and its interaction with homeostasis

Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011Microvesicular steatosis is a chronic hepatocellular change potentially induced by valproic acid (VPA). This effect has often been associated with a disturbed fatty acid metabolism and an altered dynamic balance of the essential co-factor coenzyme A (CoA). Furthermore, the parent drug or its metabolites may interact with mitochondrial metabolism at several sites, thereby deranging cellular functions. The experimental work presented in this thesis aimed to 1.) elucidate the impact of valproate on CoA and carnitine homeostasis, 2.) shed new light on the mitochondrial oxidative biotransformation of the drug and 3.) understand the interactions of valproyl-CoA with different functions of mitochondria. Valproate-induced mitochondrial dysfunction is often related to a potential secondary carnitine deficiency. The study of valproate interference on mitochondrial metabolism and CoA homeostasis was first focused on the evaluation of carnitine status in animal tissues using electrospray tandem mass spectrometry, since both cofactors are strictly related. Our studies showed a significant dose-related increase of free carnitine and total acylcarnitine levels in the livers of rats treated with a single dose of sodium valproate. However, these levels appeared to recover after a subchronic treatment, except from specific acylcarnitines derived from branched-chain-2-ketoacids and straight medium-chain fatty acids that remain elevated. In addition, γ-butyrobetaine dioxygenase activity was induced and γ-butyrobetaine levels were increased in the liver. The inter-organ redistribution of carnitine and stimulation of endogenous carnitine biosynthesis seem to be crucial for the immediate rescue of hepatic free carnitine levels. Moreover, the disturbances in rat liver acylcarnitines were suggestive of an altered CoA metabolism. The hepatocellular levels of free and total CoA were quantified in the biological samples. A clear depletion of hepatic free CoA was observed at the onset of VPA treatment in rats. The levels of CoA normalized after prolonged treatment with VPA probably due to active adaptive cellular mechanisms to valproate-induced stress on mitochondrial metabolism. However, the decreased availability of this cofactor may contribute to the adverse effects associated with VPA, often observed at the start of VPA therapy or in cases of overdose. The structural similarity between the intermediates derived from the β-oxidation of VPA and from the oxidative metabolism of branched-chain amino acids (BCAAs) suggested that VPA might use key enzymes from the BCAAs catabolic pathways for its own metabolism. We have demonstrated that two enzymes from the isoleucine and leucine catabolism, namely short-branched chain acyl-CoA dehydrogenase (SBCAD) and isovaleryl-CoA dehydrogenase (IVD), are involved in the first step of the β-oxidation of VPA, the dehydrogenation of valproyl-CoA into Δ2-valproyl-CoA. We have further demonstrated that short-chain enoyl-CoA hydratase (ECHS1) and 2-methyl-3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (MHBD) are the unique enzymes hydrating Δ2-valproyl-CoA and oxidizing 3-hydroxyvalproyl-CoA, respectively. Moreover, the activity of IVD and SBCAD were inhibited in the presence of the tested VPA Summary xiv metabolites, valproyl-CoA and valproyl-dephosphoCoA. The drug metabolite 3-hydroxyvalproyl-CoA also inhibited the activity of MHBD. This result is in accordance with the increased urinary excretion of the isoleucine metabolite 2-methyl-3-hydroxybutyric acid in patients under valproate therapy. It has been reported that patients treated with valproate reveal an increased excretion of 3-hydroxyisovaleric acid in urine, a secondary metabolite of the leucine oxidative pathway. This finding has not been explained and its biochemical basis remains elusive. Our results suggest that valproyl-CoA inhibits the activity of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase (3MCC) through a direct effect on the enzyme, or through the inhibition of biotinidase. This is in agreement with the significant increased levels of 3-hydroxyisovaleric acid observed in urine of patients treated with valproate as well as with the skin rash and hair loss, which are side effects often reported in VPA-treated patients. To elucidate the underlying mechanisms of VPA-induced interferences on oxidative phosphorylation (OXPHOS), the effects of VPA and specific metabolites were studied both on the mitochondrial respiration and on the formation of ATP. Our results show that oxygen consumption and ATP synthesis were inhibited by both valproate and Δ4-VPA, when 2-oxoglutarate or glutamate, were used as respiratory substrates. Accordingly, the results demonstrated a selective and mild inhibition of dihydrolipoyl dehydrogenase (DLDH) (E3 subunit) activity by valproyl-CoA, which suggest that valproate might limit energy production in mitochondria. In addition, the measurement of the GTP- and ATP-specific succinate:CoA ligases (G-SUCL and A-SUCL) activity revealed that valproyl-CoA was found to inhibit the activity of SUCL, in particular the ATP-specific enzyme. Since SUCL is a crucial enzyme in the Krebs cycle, interference with its activity might derange the cellular energy status. Furthermore, valproate might induce an imbalance of nucleotides in mitochondria explaining the potential valproate-induced liver failure in patients with deficiencies within the mitochondrial DNA replicase such as polymerase γ 1. The elucidation of the interference of valproate with mitochondrial metabolism promoted by the present studies, may explain the potencial idiosyncratic reaction reported in patients treated with the drug. The prescription of valproate should be carefully considered in patients with inborn errors of metabolism affecting not only fatty acid oxidation and urea cycle but also the oxidative pathways of branched-chain amino acids, the krebs cycle and the DNA replicase system.O uso terapêutico do ácido valpróico (VPA) pode induzir uma esteatose hepática microvesicular entre outros efeitos adversos. Este efeito toxicológico tem sido frequentemente associado a uma alteração no metabolismo dos ácidos gordos e do coenzima A (CoA), um cofactor crucial ao metabolismo celular. Por outro lado, o fármaco ou os seus metabolitos podem desencadear outros efeitos em vias importantes do metabolismo mitocondrial, comprometendo várias funções celulares. Os estudos apresentados nesta tese foram planeados de modo a contribuir para: 1.) esclarecer o impacto do VPA na homeostase de CoA e de carnitina; 2.) elucidar a biotransformação oxidativa mitocondrial do fármaco e 3.) aprofundar o conhecimento existente acerca da interacção do valproil-CoA com o metabolismo mitocondrial. A hepatotoxicidade induzida pelo VPA é frequentemente associada à disfunção mitocondrial e também a uma potencial deficiência secundária em carnitina. O estudo da interferência do VPA no metabolismo mitocondrial e na homeostase da coenzima A visou numa fase inicial a avaliação do status em carnitina, uma vez que ambos são estritamente interdependentes. Deste modo, os níveis de carnitina e perfis de acilcarnitinas foram estudados em tecidos (fígado, músculo, coração e rim) de ratos Wistar tratados com valproato de sódio, recorrendo a métodos por espectrometria de massa em série (tandem) com ionização electrospray. Os resultados demonstram que no fígado dos animais tratados com administrações únicas de VPA existe um aumento dos níveis de carnitina livre e acilcarnitinas totais, proporcional à dose de fármaco. Contudo, depois de um tratamento subcrónico, os níveis destes metabolitos não são significativamente diferentes dos controlos, com a excepção de certas acilcarnitinas derivadas dos intermediários da oxidação de 2-ceto-ácidos de cadeia ramificada e de ácidos gordos de cadeia média, que permanecem elevados. Observou-se igualmente uma indução da actividade da dioxigenase da γ-butirobetaína bem como um aumento nos níveis hepáticos de γ-butirobetaína. Os resultados sugerem uma redistribuição de carnitina entre os órgãos em análise, bem como uma estimulação da biossíntese de carnitina. Estes dois efeitos parecem cruciais à regulação dos níveis hepáticos de carnitina após tratamento com o fármaco, evidenciando-se como importantes mecanismos de adaptação in vivo às alterações no metabolismo mitocondrial induzidas pelo valproato. A hipótese de uma potencial depleção de CoA é muitas vezes colocada como uma das maiores causas de disfunção mitocondrial associada à terapêutica com valproato. As alterações verificadas nos níveis de acilcarnitinas sugerem uma interferência simultânea na homeostase de CoA provocada pelo fármaco. Deste modo, no sentido de elucidar os efeitos do valproato nos níveis hepatocelulares de CoA, foi desenvolvido um método analítico por HPLC e com detecção fluorimétrica para quantificar níveis de CoA livre e total em amostras biológicas com especial relevância para o tecido hepático. Os resultados obtidos demonstraram uma depleção Sumário xvi pronunciada na concentração de CoA livre no início do tratamento com valproato. Após um tratamento continuado a concentração de CoA livre não é significativamente diferente dos respectivos controlos, evidenciando uma activação de mecanismos celulares compensatórios. Contudo, o decréscimo da disponibilidade deste cofactor poderá contribuir para os efeitos adversos do VPA manifestados muitas vezes no início da terapia ou em casos de sobredosagem. A semelhança estrutural entre os intermediários da β-oxidação do ácido valpróico e os intermediários da degradação dos aminoácidos ramificados (BCAAs) sugere o envolvimento de enzimas chave da degradação dos BCAAs na biotransformação do próprio fármaco. Para clarificar a interferência do VPA no metabolismo dos BCAAs foram estudadas in vitro três enzimas humanas recombinantes: a desidrogenase do isovaleril-CoA (IVD), a desidrogenase do isobutiril-CoA (IBD) e a desidrogenase dos acil-CoAs de cadeia curta ramificada (SBCAD), participantes nas vias oxidativas da leucina, valina e isoleucina, respectivamente. Observou-se uma redução na actividade das enzimas IVD e SBCAD em presença dos metabolitos do fármaco, valproil-CoA e valproil-defosfoCoA, não se verificando porém alteração na actividade da IBD. No sentido de clarificar a primeira reacção de desidrogenação da β-oxidação do VPA, a actividade das três desidrogenases foi testada usando como substrato o valproil-CoA. A SBCAD foi a enzima que demonstrou maior actividade na biotransformação do valproil-CoA, sendo portanto a principal responsável pela primeira reacção de β-oxidação do fármaco. Subsequentemente, foram estudados os dois passos sequenciais da via oxidativa do metabolito produzido, Δ2-valproil-CoA. As actividades da desidrogenase do 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA (MHBD) e da hidratase do enoil-CoA de cadeia curta (ECSH1, crotonase) foram investigadas em presença dos intermediários da oxidação do VPA como potenciais substratos. Os resultados obtidos demonstraram que a MHBD é a única enzima responsável pela oxidação do 3-hidroxivalproil-CoA a 3-ceto-valproil-CoA, sendo o primeiro metabolito um inibidor da actividade da MHBD. Este efeito explica em parte o aumento do ácido 2-metil-3-hidroxibutírico, um metabolito secundário da oxidação da isoleucina, observado em urinas de doentes medicados com VPA, bem como o aumento na excreção de 2-metil-3-hidroxibutirilcarnitina. Foi também demonstrado o envolvimento da crotonase, como única hidratase interveniente na β-oxidação do VPA. Vários estudos apresentados na literatura referentes a doentes medicados com valproato descrevem um aumento da excreção urinária do ácido 3-hidroxisovalérico, um metabolito secundário da via oxidativa da leucina. Para justificar esta alteração, investigaram-se os efeitos do VPA e do valproil-CoA na actividade da biotinidase e da carboxilase do 3-metilcrotonil-CoA (3MCC), uma enzima dependente de biotina. Demonstrou-se um decréscimo na actividade da 3MCC através de dois mecanismos possíveis: uma inibição directa da actividade da enzima pelo valproil-CoA e um decréscimo de actividade da biotinidase. Estes resultados sugerem um efeito inibitório na actividade da 3MCC, contribuindo para o aumento da excreção urinária de Sumário xvii ácido 3-hidroxisovalérico. Este efeito justifica, pelo menos em parte, a observação clínica de rash cutâneo e queda de cabelo frequentemente reportados em doentes sob terapia com VPA. Para clarificar os mecanismos subjacentes aos efeitos do VPA na fosforilação oxidativa, os efeitos do fármaco e de dois intermediários insaturados do seu metabolismo foram testados na síntese de ATP e na respiração mitocondrial, na presença de alguns substratos respiratórios específicos. Os resultados obtidos revelaram que o VPA e o Δ4-VPA exercem um efeito inibitório significativo da síntese de ATP e do consumo de oxigénio na presença de glutamato e α-cetoglutarato. Uma explicação para estes resultados reside na inibição da desidrogenase da di-hidrolipoamida (subunidade E3) induzida pelos metabolitos do fármaco. Os resultados obtidos indicam um efeito moderado sobre este enzima, mas o impacto poderá ser significativo ao nível do equilíbrio energético da mitocôndria, dada a importância dos complexos multienzimáticos contendo a subunidade E3. Por outro lado, estudou-se também o efeito do VPA e do éster de CoA correspondente (valproil-CoA) na actividade das ligases sucinato:CoA dependentes de GTP e ATP (G-SUCL e A-SUCL). Observou-se um decréscimo na actividade das duas SUCLs na presença de valproil-CoA, particularmente da A-SUCL. Considerando o papel crucial da A-SUCL no ciclo de Krebs, a inibição desta enzima poderá ter consequências relevantes no metabolismo celular. Adicionalmente, o valproato poderá provocar um desequilíbrio do conteúdo em nucleótidos na mitocôndria, pois pensa-se que a proteína A-SUCL está fortemente ligada a uma cinase dos nucleósidos difosfato (NDPK). Este resultado é particularmente relevante para a compreensão da disfunção hepática, por vezes de consequências bastante graves, em doentes com deficiências no sistema de replicação de DNA mitocondrial, como por exemplo na polimerase γ 1. A elucidação da interferência do ácido valpróico com o metabolismo mitocondrial, promovida pelos estudos apresentados nesta tese, pode explicar a potencial reacção idiossincrática manifestada em doentes tratados com o fármaco. A prescrição de valproato deve ser cuidadosamente ponderada em doentes com doenças hereditárias do metabolismo, afectando não só a oxidação mitocondrial dos ácidos gordos e ciclo da ureia como também as vias oxidativas dos aminoácidos ramificados, o ciclo dos ácidos tricarboxílicos e o sistema de replicação do DNA mitocondrial.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/25913/2005