The efects of low-dose ionizing radiation on angiogenesis

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Celular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Angiogenesis is the formation of new blood vessels from pre‐existing ones. This process is regulated by a balance between pro‐ and anti‐angiogenic molecules and is derailed in various diseases, such as cancer. Radiotherapy is a commonly‐used treatment for cancer. However, recent studies suggest that ionizing radiation (IR) doses delivered inside the tumor target volume during fractionated radiotherapy can stimulate invasion and metastasis through effects on cancer cells but also on other elements of the microenvironment. Furthermore, radiotherapy results also in the delivery of doses lower that the therapeutic ones to the tissues surrounding the tumor area, and the biological effects of these low IR doses remain largely undetermined. Our overall goal was to investigate the effects of these low IR doses on angiogenesis, and consequently in tumor progression and metastasis. We showed that low‐dose IR induces an angiogenic response both in vitro and in vivo. Doses equal or lower than 0.8 Gy promote endothelial cell migration without causing cell cycle arrest or apoptosis, activate vascular growth factor (VEGF) receptor‐2 and upregulate the expression of VEGF. In zebrafish, low‐dose IR accelerates sprouting angiogenesis during development and enhances angiogenesis during regeneration. In mice, we showed that low‐dose IR promotes angiogenesis resulting in accelerated tumor growth and metastasis formation in a VEGFR‐dependent manner. Additionally, we demonstrated that low‐dose IR modulates the gene expression of molecular mediators involved in the angiogenic response. Our observations provide novel insights into the biological effects of low‐dose IR relevant to tumor biology, which may serve as basis for the prevention of possible tumorpromoting effects of current radiotherapy protocols. Therefore, according to our findings low‐dose IR induces angiogenesis in vivo but, there is no evidence that it produces therapeutic angiogenesis in ischemic disease patients. In the second part of this work we showed that low‐dose IR potentiates the pro‐angiogenic effect of vasoprost®, commonly used in the treatment of peripheral arterial disease treatment (PAD). Our results suggest that the combinatory use of both vasoprost® and low‐dose IR should be considered for future studies concerning its clinical therapeutic potential in pathologies such as PAD.A angiogénese é o processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré‐existentes. Em situações fisiológicas a angiogénese ocorre durante o desenvolvimento embrionário, crescimento de órgãos e, no adulto, em processos de cicatrização de feridas e ciclo reprodutivo. Nestas condições, o processo angiogénico é fortemente controlado por um equilíbrio complexo entre factores estimuladores (próangiogénicos) e inibidores (anti‐angiogénicos). A angiogénese pode, no entanto, ocorrer em situações patológicas onde há uma perda do equilíbrio entre factores pró‐ e anti‐angiogénicos, resultando numa vascularização excessiva ou deficiente. O cancro é uma das patologias que se caracterizam por um excesso de angiogénese. A radioterapia é frequentemente aplicada ao tratamento do cancro. Porém, tem vindo a ser observado que doentes submetidos a esta terapia têm um risco aumentado de desenvolver metástases. Esta situação constitui um desafio para a clínica e os mecanismos celulares e moleculares que estão na origem deste problema têm vindo a ser investigados. É geralmente assumido que a metastização e recidiva tumoral após a terapia se devem ao aparecimento de células tumorais resistentes à radiação ionizante. No entanto, há evidências de que doses terapêuticas de radiação ionizante promovem alterações ao nível do microambiente tumoral, podendo também contribuir para o processo de radioresistência. A vasculatura providencia oxigénio e nutrientes ao tumor, sendo essencial para o seu desenvolvimento. Contudo, favorece também a metastização, na medida em que as células tumorais entram em circulação através de vasos sanguíneos. A contribuição da vasculatura irradiada na invasão e metastização após radioterapia é, portanto, de extrema importância. Por este motivo, ao longo dos últimos anos, têm surgido diversos estudos com o objectivo de perceber através de que mecanismos, doses de radiação ionizante induzem a angiogénese na área tumoral e qual poderá ser a sua contribuição no processo de invasão e metastização. Estes estudos têm‐se focado em doses de radiação ionizante que são administradas diariamente, em pequenas fracções, até que a dose potencialmente curativa seja acumulada no interior da área a tratar, com o objectivo de minimizar o dano provocado nos tecidos saudáveis. Para além disso, a administração em baixas doses e a convergência de diversos feixes que garantem a distribuição homogénea das curvas de isodose em radioterapia externa, contribuem para a existência de uma menor dose de radiação ionizante fora da área a tratar. Os efeitos biológicos e moleculares destas baixas doses de radiação ionizante nos tecidos que rodeiam a área a tratar são ainda desconhecidos. O nosso trabalho centrou‐se, de forma inovadora, na vasculatura que rodeia o tumor e que recebe doses relativamente baixas de radiação ionizante. O principal objectivo, foi investigar o efeito destas baixas doses de radiação ionizante na angiogénese, e compreender a sua contribuição para a recidiva tumoral, invasão e metastização. Investigámos assim o efeito das baixas doses de radiação ionizante in vitro, em células endoteliais humanas de microvasculatura de pulmão (HMVEC‐L, lung human microvascular endothelial cells) e células endoteliais de veia umbilical (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells). Constatámos que doses iguais ou inferiores a 0.8 Gy promovem a migração de células endoteliais, sem afectar a sobrevivência e o ciclo celular, activam o receptor‐2 do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF, vascular endothelial growth factor) e, em condições de hipóxia, promovem o aumento da expressão do próprio VEGF. A utilização do peixe‐zebra como modelo de estudo permitiu‐nos confirmar in vivo a indução da angiogénese em resposta a baixas doses de radiação ionizante. Observámos que doses de 0.5 Gy aceleram o processo angiogénico durante o desenvolvimento embrionário e promovem um aumento do número de vasos durante a regeneração da barbatana caudal dos adultos. Para estudarmos a contribuição das baixas doses de radiação ionizante no crescimento tumoral e metastização, utilizámos dois modelos experimentais de ratinho: um modelo de leucemia, e um modelo metastático de cancro de mama. Verificámos que baixas doses de radiação ionizante promovem o crescimento tumoral e metastização através de um mecanismo dependente do receptor do VEGF. O efeito das baixas doses de radiação no desenvolvimento tumoral também foi estudado utilizando um modelo de melanoma em peixe‐zebra. Neste modelo, os peixes‐zebra mutantes em p53 (protein 53) e BRAF (raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) são expostos a baixas doses de radiação ionizante antes do melanoma ser detectado. De acordo com os nossos resultados, não publicados, é desenvolvido um maior número de melanomas em peixes zebra irradiados. Verificámos igualmente, que os melanomas nestes peixes irradiados apresentam um tamanho superior em relação aos melanomas desenvolvidos em peixes‐zebra não irradiados. Estudos adicionais estão a ser efectuados com o objectivo de caracterizar os melanomas que surgem em ambos os grupos experimentais. Finalmente, e com o objectivo de identificar os mecanismos através dos quais as baixas doses de radiação ionizante induzem uma resposta pró‐angiogénica, investigámos o perfil de expressão génica de HMVEC‐L irradiadas versus não irradiadas. Os nossos resultados indicam a modulação da expressão génica de mediadores moleculares envolvidos na resposta angiogénica. No seu conjunto, o nosso trabalho permite compreender o efeito das doses de radiação ionizante que estão presentes nos tecidos que rodeiam a área tumoral e sua importância na angiogénese, e consequentemente na progressão tumoral e metastização, pelo que poderá ser um contributo importante na optimização dos actuais protocolos de radioterapia. Assim, de acordo com os nossos resultados as baixas doses de radiação ionizante induzem angiogénese in vivo; não existe, contudo, prova de que induzam angiogénese terapêutica em doentes com doença isquémica, sendo este um dos objectivos de investigação do nosso laboratório. A isquémia crítica dos membros inferiores é uma das manifestações clínicas da doença arterial periférica em que se descreve doentes com dor em repouso ou com lesões tróficas cutâneas, sejam elas úlceras ou gangrena. A Isquemia crítica dos membros inferiores envolve uma perturbação grave tanto ao nível da microcirculação como da macrocirculação. O vasoprost® é frequentemente utilizado no tratamento da doença arterial periférica. O princípio activo do vasoprost® é a prostaglandina E1 (alprostadil), cujas propriedades hemodinâmicas e acção anti‐agregante plaquetária justificam a sua indicação no tratamento da doença vascular periférica grave. No entanto, a literatura não é unânime quanto à sua função como indutor angiogénico. Por este motivo, e através da realização de um conjunto de ensaios in vitro, em HUVEC, começámos por clarificar este assunto. Os nossos resultados sugerem que o vasoprost® funciona como um agente pró‐angiogénico, induzindo a migração, proliferação e sobrevivência endotelial. O uso de vasoprost® na clínica apresenta, contudo, limitações terapêuticas. Assim, a amputação surge como última alternativa terapêutica, apesar das taxas de morbilidade e mortalidade associadas. O objectivo de preservar o membro tem estimulado a investigação de tratamentos alternativos, incluindo a angiogénese terapêutica. Propusemo‐nos então a averiguar se baixas doses de radiação ionizante poderiam potenciar os resultados obtidos pelo tratamento com o vasoprost®. Avaliámos a acção combinada destes dois agentes e verificámos in vitro que doses de radiação ionizante inferiores a 0.8 Gy potenciam o efeito pró‐angiogénico do vasoprost®. Os nossos resultados sugerem deste modo, que a combinação da radiação ionizante e vasoprost® devem ser considerados em estudos futuros, de forma a avaliar o seu potencial terapêutico na doença arterial periférica.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT,SFRH / BD / 27541 / 2006