Pró-fármacos de triazenos anti-tumorais para estudos ADEPT e MDEPT

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009Actualmente existem muitas doenças que são alvo de investigação, sendo exemplo o melanoma, um cancro de pele maligno. Apesar dos mecanismos e vias envolvidos no desenvolvimento e aparecimento deste tipo de cancro estarem já bem estudados, ainda não se encontrou o tratamento ideal. Os triazenos, uma sub-classe dos agentes anti-tumorais alquilantes, têm sido usados no tratamento do melanoma metastático. No entanto, verificou-se que havia alguma falta de especificidade destes agentes alquilantes para com as células tumorais. Como tal, tem-se vindo a desenvolver novas abordagens que possam melhorar a especificidade dos triazenos e assim proporcionar melhores resultados terapêuticos, sendo tema do corrente projecto duas dessas novas abordagens. A primeira a ser abordada vai ser a metodologia anti-tumoral Antibody-Directed- Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT), a qual se caracteriza pela introdução de um complexo enzima-anticorpo, em que o anticorpo é específico para um determinado antigénio no tumor e o enzima é específico para um determinado pró-fármaco de um anti-tumoral. O pró-fármaco será injectado numa segunda fase, levando assim à libertação do fármaco após activação na zona afectada. Numa primeira fase, propomonos desenvolver dois pró-fármacos de anti-tumorais, os quais consistem na junção da cefalosporina GCLE, bom substrato para o enzima β-lactamase, e do anti-tumoral monometiltriazeno (MMT). Procederam-se a diversas tentativas para a síntese destes dois pró-fármacos, não se tendo obtido os pró-fármacos desejados, embora se tenha obtido sucesso em várias fases da síntese. A segunda metodologia corresponde a uma abordagem anti-tumoral denominada por Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT), a qual se baseia numa propriedade que os melanomas têm, que consiste na presença em excesso de um enzima nos melanócitos, o tirosinase. Nesta segunda parte do projecto, sintetizaram-se quatro compostos, constituídos por um bom substrato para o enzima tirosinase e um triazeno, o qual vai variando no substituinte do anel aromático. Após a sua síntese, purificação e caracterização espectroscópica, realizaram-se estudos de estabilidade em tampão fosfato pH=7.4, 0.01 M, e em plasma humano 80% (v/v), bem como estudos cinéticos frente ao enzima, recorrendo à técnica de HPLC, para se verificar a sua possível utilização na abordagem terapêutica MDEPT. Através dos resultados obtidos nos estudos realizados, foi possível concluir-se que os pró-fármacos de triazenos sintetizados são possíveis pró fármacos a usar na metodologia MDEPT, uma vez que são compostos estáveis em plasma e apresentam tempos de semi-vida reduzidos quando em presença do enzima tirosinase, o que leva à rápida libertação do MMT. De modo a confirmar se a libertação do triazeno desencadeada pela acção do enzima tirosinase corresponde a uma acção na ponte peptídica ou se é devido ao reconhecimento do grupo fenol da tirosina, realizou-se um ensaio controlo em que se procedeu a um ensaio enzimático com um composto que não possuía o grupo fenol da tirosina, o acetil-fenilalanina-MMT-CN. Verificou-se que o tempo de semi-vida se apresentava próximo dos valores já anteriormente alcançados em estudos de estabilidade em tampão fosfato, pelo que a presença do grupo fenol é essencial na libertação do triazeno.The cancer is one disease that was been studied during several years. Although the extensive investigation involving this matter, there isn’t one therapy with success to cure this harmful disease. One type of cancer that is being of great interest of researchers is the melanoma that is a malign skin cancer. The best treatment found for this kind of tumor is the anticancer drugs triazenes, which are grouped in the anticancer alkilating agents. However, due to their lack of specifity to the tumour cells, it became urgent find other kinds of therapies that could perform this property. With this propose, this project will inside on the synthesis of new prodrugs of anticancer triazenes that will be used in two new methodologies, called Antibody- Directed-Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT) and Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT). ADEPT is a new form of cancer therapy which aims to selectively deliver drugs to tumour sites. This is achieved by targeting an enzyme to the tumour using a monoclonal antibody, then administering a non-toxic prodrug which will be converted by the enzyme to a potent anti-tumour agent. Relatively to the MDEPT approach, this one differs from the earlier protocol in that the activating mechanism relies upon the enzyme tyrosinase, which is already present in melanoma cells. Indeed, the enzyme is uniquely associated with melanocytes, suggesting a highly focused drug delivery system. Thus, the attachment of a lethal drug to a tyrosine analogue would liberate the free drug at the tumour site. In this way, in first hand, we will try to synthesize two new prodrugs, consisting in the addiction of a cephalosporin (GCLE), which is a good substrate to the enzyme β- lactamase, to a triazene, monomethyltriazene (MMT). Although the innumerous tries to synthesize these prodrugs, our proposes weren’t achieved, although we had some good results in some parts of the synthesis of this prodrugs. In the second part, we had synthesized four new prodrugs of triazenes, which consist in the attachment of a triazene with a tyrosine analogue, N-acyl-L-tyrosine. After this, we proceed to the stability studies in Phosphate buffer, pH 7.4, 0.01 M, and in human plasma 80 %, as well enzymatic studies with tyrosinase, in all using the high performance liquid chromatography (HPLC). In conclusion of this part we had positive results, once the prodrugs synthesized are good prodrugs to use in the MDEPT methodology. They presented a good stability on plasma and a reduced half-life time in the presence of tyrosinase. We had also made a control study, to verify how the enzyme tyrosinase acts to free the triazene. To do this we have proceed to an enzymatic study of a prodrug, which don’t possess the group phenol of the aminoacid, called acyl-phenylalanine-MMT-CN. We have seen that in the presence of the tyrosinase, the acyl-phenylalanine-MMT-CN have half-life time similar with the one obtained previously in stability studies in phosphate buffer, by which the presence of the phenol group is essential to liberate the triazene