Phytochemical study of Coreopsis tinctoria and evaluation of its antidiabetic properties

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011Coreopsis tinctoria Nutt. is a small aromatic annual and widely distributed plant that belongs to the Asteraceae family. Its use in traditional medicine has been described as early as the XVII century in China, where its decoction has been used for diarrhoea. Other medicinal properties have been added by North American Indians and include treatment of internal pains, bleeding, to strengthen blood and as an emetic. In Portugal, an infusion of the flowering tops has been described to have antidiabetic proprieties, applied to diabetes type 2 treatment. There are some published phytochemical studies on the genus Coreopsis but the information on this species chemical composition, until recently, was scarce. Flavonoids of chalcone, aurone and flavanone structure have been described in C. tinctoria flowering tops although there was no available information on the chemical constitution of bioactive extracts. Flavonoids are polyphenols well known for their antioxidant and cytoprotective activity that have also been shown to act at several levels in the glucose metabolism, which may be of relevance in the prevention and treatment of diabetes and its complications. Thus the present study aimed to: i) search for new antidiabetic lead molecules able to reduce both glycemia and tissue damage; ii) chemically characterize the bioactive extracts, and; iii) study the antidiabetic profile of extracts and metabolites of C. tinctoria as this species lacked any kind of pharmacological and toxicological data. The aqueous extract of C. tinctoria flowering tops was prepared following the traditional recipe. Fractionation by chromatography followed, and three major compounds were isolated and identified by spectroscopic methodologies. Other thirteen phenolic compounds were identified by HPLC-DAD-MS/MS. Through this technique, reproducible methods for quantitative analysis of the main compounds in bioactive extracts were also developed. Further on, to evaluate whether C. tinctoria had a beneficial effect on diabetes some in vivo assays were performed. In order to test for acute antihyhyperglycemic activity, the aqueous extract was administered to normal (euglycemic) rats at different concentrations and blood glucose levels were monitored by an oral glucose tolerance test. None of concentrations tested have shown significant lowering blood glucose effect compared to control group. In order to understand other possible glucose lowering effects, a streptozotocininduced glucose-intolerant rat model was developed. C. tinctoria aqueous extract (500 mg/Kg) was then daily administrated during three weeks which resulted in significant recovery of glucose tolerance. The active extract was quantified in terms of its main compound, the chalcone marein. As means to determine whether flavonoids were the bioactive compounds, a flavonoid-rich AcOEt fraction (125 mg/Kg), with the same marein content as the bioactive aqueous extract, was prepared and administered to the glucose-intolerant model. Results indicated glucose tolerance regain after only two weeks of treatment, an effect that was maintained over the remaining experimental period. Moreover, lipase values normalized indicating re-establishment of pancreatic function. In addition, the oral treatment with either C. tinctoria aqueous extract or AcOEt fraction caused no hepatotoxicity. Regarding cytotoxicity, C. tinctoria extracts were tested in vitro, using a pancreatic mouse insulinoma cell line (MIN6). Cell viability tests were performed and no cytotoxic effects were observed at the concentrations tested (up to 3 mg/mL). Possible insulin-secretagogue action of the bioactive C. tinctoria extracts was evaluated in two ways: i) using MIN6 cells disposed as monolayers through static incubation method or; ii) in a more sensitive model, using MIN6 cells disposed in three dimensional structures (pseudoislets) using a perifusion technique. Both yielded data that seems to indicate that C. tinctoria extracts do not act increasing insulin secretion. C. tinctoria extracts and pure compounds (marein and flavanomarein), known to be good antioxidants, were then tested for their potential protective effects in MIN6 cells challenged with pro-oxidant tert-Butyl-Hydroperoxide (tBHP) or cytokines. Results indicate that C. tinctoria extracts and pure compounds are effective cytoprotectors, which seems to be due to inhibition of the apoptotic pathway, and not through a decrease on superoxide radical production. Overall, these results support the conclusion that phenolic compounds present in C. tinctoria flowering tops extracts promote recovery of pancreatic function and glucose intolerance possibly by an anti-apoptotic mechanism of injured pancreas, suggesting C. tinctoria traditional use in diabetes therapyCoreopsis tinctoria Nutt. é uma pequena planta aromática anual, amplamente distribuída, pertencente à família das Asteraceas. Trata-se de uma planta cujo primeiro registo de utilização na medicina tradicional, data do século XVII na China, onde a sua decocção tem sido aplicada para a diarreia. Outras aplicações medicinais foram entretanto desenvolvidas por outros povos, nomeadamente, pelos Índios da América do Norte para o tratamento de dores, hemorragias, para fortalecimento do sangue e como um emético. Em Portugal, a infusão dos ápices florais de Coreopsis tinctoria, também conhecida como Estrelas-do-Egipto, foi descrita como tendo propriedades antidiabéticas, passível de ser aplicada no tratamento da diabetes do tipo dois. Existem já alguns estudos publicados na área da fitoquímica, aplicados ao género Coreopsis. No entanto, até muito recentemente, o conhecimento da composição química da espécie Coreopsis tinctoria era escasso. Flavonóides com estrutura do tipo chalcona, aurona e flavanona foram já descritos nos ápices florais desta espécie, apesar de não existir nenhuma informação sobre a constituição química de extractos bioactivos. Os flavonóides são compostos fenólicos bem conhecidos pela sua actividade antioxidante e citoprotectora, tendo também demonstrado efeitos a vários níveis no metabolismo da glucose, o que pode ser relevante na prevenção e tratamento da diabetes e das complicações macro e micro vasculares associadas a esta patologia. Tendo em conta todos estes factores, os principais objectivos deste projecto foram: i) a pesquisa de novas moléculas com potencial antidiabético capazes de reduzir tanto a glicémia como a danificação de tecidos, ii) caracterizar quimicamente os extractos bioactivos, e, iii) desenvolver um estudo do perfil antidiabético dos extractos e metabolitos presentes na Coreopsis tinctoria, na medida em que sobre esta espécie não havia até então, nenhum tipo de dados farmacológicos nem informação relativa à sua possível toxicidade. O extracto aquoso dos ápices florais da Coreopsis tinctoria foi preparado de acordo com a utilização tradicional em Portugal. Seguiu-se o fraccionamento cromatográfico, do qual se obtiveram três compostos maioritários, que foram isolados e identificados recorrendo a metodologias espectroscópicas. Outros treze compostos fenólicos foram identificados por HPLC-DAD-MS/MS. Através desta técnica, foram também desenvolvidos métodos para a análise quantitativa dos principais compostos presentes nos extractos bioactivos. No seguimento dos objectivos deste projecto, de forma a avaliar os potenciais efeitos benéficos da infusão (extracto aquoso) dos ápices florais da Coreopsis tinctoria na diabetes, procedeu-se ao estudo farmacológico, desenvolvendo alguns ensaios in vivo. Para testar a actividade antihiperglicémica aguda, administraram-se diferentes concentrações do extracto aquoso a ratos normais (euglicémicos) e, seguidamente, monitorizaram-se os níveis de glucose no sangue através do teste oral de tolerância à glucose. Nenhuma das concentrações testadas revelou um efeito significativo de diminuição dos valores de glucose no sangue comparando com o grupo controlo. Para compreender a possibilidade de outros efeitos estarem envolvidos na capacidade desta planta afectar os níveis de glucose no sangue, foi desenvolvido, em ratos Wistar, um modelo de intolerância à glucose (40 mg/Kg de estreptozotocina), na medida em que esta é característica numa situação de pré-diabetes e pode constituir por si só um risco no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. O extracto aquoso (500 mg/Kg) foi então administrado diariamente e por sonda intragástrica durante três semanas a ratos Wistar intolerantes à glucose, tendo resultado na recuperação dos níveis de glicémia. O composto identificado como maioritário, a chalcona mareina, foi quantificado no extracto activo. Como forma de determinar se os flavonóides eram os compostos bioactivos no extracto aquoso, uma fracção de acetato de etilo, rica em flavonóides mas com igual conteúdo em mareina, foi preparada e administrada (125 mg/Kg) aos ratos Wistar intolerantes à glucose. Os resultados revelaram, logo ao fim de duas semanas de.tratamento, uma normalização das curvas de glicémia, efeito que se manteve até ao final do período experimental. Adicionalmente observou-se uma recuperação da função pancreática medida pelos níveis de lipase plasmática. É de salientar, que os animais tratados com ambos, extracto aquoso e fracção de Acetato de Etilo, não apresentaram sinais de hepatotoxicidade, após três semanas de tratamento. Relativamente à citotoxicidade, os referidos extractos foram testados in vitro usando uma linha celular pancreática derivada de insulinoma de murganho (MIN6). Testes de viabilidade celular foram efectuados não revelando efeitos de toxicidade nas concentrações testadas (até 3 mg/mL). Uma possível acção insulino-secretagoga dos extractos bioactivos da Coreopsis tinctoria foi investigada de duas formas: i) usando células MIN6 dispostas em monocamada, através de um método de incubação estática ou; ii) utilizando um modelo mais sensível, usando células MIN6 dispostas em estruturas tridimensionais, também designadas por “pseudo-ilhéus”, recorrendo a uma técnica de perfusão. Ambas aparentam indicar que os extractos bioactivos de Coreopsis tinctoria não estimulam a secreção insulínica. Os extractos da Coreopsis tinctoria assim como os seus constituintes maioritários, mareina e flavanomareina, conhecidos por apresentarem actividade antioxidante, foram testados com o objectivo de avaliar o seu potencial efeito protector em células MIN6 expostas ao pro-oxidante, terc-Butil-Hidroperóxido (tBHP,) ou a um conjunto de citocinas. Os resultados revelaram, que tanto os extractos da Coreopsis tinctoria, assim como a mareina e a flavanomareina são efectivamente protectores, o que parece ser devido a uma inibição da via apoptótica e não à diminuição da produção do radical superóxido. Em conclusão, estes resultados tendem a indicar, que os compostos fenólicos presentes nos extractos dos ápices florais da Coreopsis tinctoria, promovem a recuperação da função pancreática e consequentemente revertem a situação de intolerância à glucose possivelmente através de um mecanismo anti-apoptótico no tecido pancreático danificado, o que não contraria o uso tradicional da Coreopsis tinctoria na terapia da diabetes.Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT