Calcium-activated chloride in cystic fibrosis

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Proper ion transport is crucial for maintenance, hydration and also protection against infection of epithelial tissues. The dysfunction of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Cl- channel results in Cystic Fibrosis (CF), the most common genetic disease among Caucasians. CFTR and Ca2+-activated Cl- channels (CaCCs) are main Cl- channels present in the respiratory epithelia and are stimulated by cAMP and Ca2+, respectively. Data demonstrating upregulated Ca2+ activated Cl- currents (ICaCC) when CFTR is absent or defective have been well described for long and are of remarkable interest for further studies and potential therapeutic approaches to CF. In the first part of this doctoral work, we used Anoctamin 1 (Ano 1) null mice to look into the role of CaCCs in the airways, so as to elucidate the potential contribution of this alternative Cl- channel to tissue homeostasis. Ussing chamber measurements were made on freshly isolated tracheas from newborn Ano -/- and Ano +/+ mice. Application of the muscarinic M3 receptor agonist carbachol (CCH) or apical stimulation of purinergic receptors through UTP and ATP was performed to elicit Ca2+-activated Cl- secretion. In Ano 1 +/+ mice, CCH induced Cl- secretion was sensitive to the CaCCs inhibitor niflumic acid and also to Ca2+ depletion from the endoplasmic reticulum (ER). On the other hand, in Ano 1 -/- animals Cl- secretion was completely abolished when using CCH as an agonist. Additionally, both UTP and ATP evoked a transient Cl- secretion in Ano 1 +/+ tracheas, but had only small effects on Ano 1 -/- tracheas. We also indirectly evaluated the efficiency of mucociliary transport in the airways upon cholinergic stimulation by measuring the movement of polystyrene microspheres over time on fleshly isolated tracheas. Particle transport was activated in Ano 1 +/+ tracheas by stimulation with CCH, while on Ano 1 -/- tissues a lack of cholinergic mucociliary clearance was observed. Altogether, our results demonstrate that in the absence of Ano 1 both Cl- secretion and mucociliary clearance are impaired, pointing towards a critical role of Ano 1 in the airways. Furthermore, we speculate that the novel insights in the function of Ano 1 provide the basis for novel treatments in CF (the so-called "bypass therapies"), being Ano 1 an alternative conductor of Cl- when CFTR is absent or defective. In the second part of this work we aimed to investigate the link between CFTR and CaCCs. We first compared the mRNA levels of membrane localized Ano 1, as well as those of Bestrophin 1, in freshly isolated nasal cells from F508del-homozygous CF patients and non-CF healthy controls. We also compared the mRNA levels of these channels in cell lines stably expressing wild type (wt) or F508del-CFTR. In both cases no increase in transcript levels of neither Ano 1 nor Best 1 was found in the F508del-CFTR cells. It is thus unlikely that changes in ion channel expression account for enhanced CaCC activity in native CF airway epithelial cells. Exposure to lipopolysaccharides (LPS) only slightly increased Ano 1 and Best 1 mRNA levels, both in wt- and F508del-CFTR cells. Taken together, the enhanced Ca2+-activated Cl- conductance observed in airway epithelial cells expressing F508del-CFTR is not explained neither by an increase in transcripts of known CaCCs nor exposure to proinflammatory agents such as LPS. We next examined whether F508del-CFTR has an effect on receptor-mediated Ca2+ signalling. Our results showed that the presence of F508del-CFTR augments receptor mediated Ca2+ signalling, comparatively to the effects observed in the presence of wt-CFTR. To elucidate the possible mechanism by which ER-localized F508del-CFTR augments intracellular Ca2+ signals, we hypothesized that F508del-CFTR trapped in the ER could affect receptor-mediated Ca2+ release from ER Ca2+ stores. Our results showed that not only UTP-induced increase in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) was largely Cl- dependent but also that the presence of F508del-CFTR in the ER may affect intracellular Ca2+ signalling by acting as a Cl- counter-ion channel, thereby facilitating Ca2+ movement across the ER membrane. Altogether, these results give new insights into the fine tuning of ion transport in the airways. Moreover, they contribute to a better understanding of the pathophysiological basis of CF disease, giving new perspectives to bypass therapies for Cystic Fibrosis.A Fibrose Quística (FQ) é uma doença genética recessiva fatal que afecta aproximadamente 70,000 doentes em todo o mundo. A população Caucasiana é a mais atingida com uma frequência de 1 em cada 2000-4500 nascimentos. A principal causa de morte decorre da doença pulmonar crónica que afecta os doentes, que se caracteriza por recorrentes infecções bacterianas nas vias respiratórias e que são principal causa da deterioração progressiva da função pulmonar. Nos pulmões de doentes com FQ, ocorre um desequilíbrio iónico do líquido que reveste as vias respiratórias designado ASL, (do inglês, airway surface liquid) levando à acumulação de um muco espesso. Esta alteração da viscosidade e de outras propriedades do muco impede o eficiente transporte mucociliar, o qual facilita a colonização por bactérias, principalmente Pseudomonas aeruginosa. As recorrentes infecções bacterianas e o processo inflamatório que daí resulta, geram um ciclo vicioso que conduz à perda progressiva da função pulmonar e na morte precoce do doente. Um dos meios de diagnóstico mais usados, mesmo após a descoberta do defeito molecular responsável pela doença, continua a ser a medição da concentração de sais no suor (esta está elevada em doentes que sofrem de FQ). Outros sintomas da FQ, incluem nomeadamente, insuficiência pancreática, meconium ileus (ileo meconial), diabetes e infertilidade masculina. De acordo com os dados mais recentes disponíveis, a esperança média de vida dos doentes é de aproximadamente 37 anos de vida. O constante aumento da esperança média de vida reflecte as consideráveis melhoras no tratamento e avanços no conhecimento da doença, nomeadamente desde a descoberta do gene que está mutado na FQ que codifica para a proteína CFTR (do inglês, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) no final dos anos 80 do século XX e a demonstração da sua função como canal transportador de iões cloreto (Cl-). Com efeito, em 1989, os esforços conjuntos de três laboratórios independentes provaram que a disfunção deste canal de Cl- era responsável pela doença. Actualmente é amplamente aceite que a proteína CFTR é essencial para a manutenção do correcto transporte iónico nas vias aéreas, tracto gastrointestinal (incluindo os ductos pancreáticos e biliares) assim como nos ductos das glândulas sudoríparas e também no tracto reprodutivo masculino. A proteína CFTR é um canal de Cl- dependente do cAMP regulado por fosforilação dependente da PKA (do inglês, protein kinase A) e que, em indivíduos saudáveis, se localiza na membrana apical das células epiteliais. Apesar de já terem sido identificadas e descritas mais de 1800 mutações em doentes FQ, a maioria (~90%) apresenta a mutação F508del pelo menos num alelo. Esta mutação impede a proteína CFTR de ser correctamente processada até à membrana apical das células epiteliais, sendo retida intracelularmente a nível do retículo endoplasmático (RE). Até à data, esta doença é incurável, estando os esforços clínicos concentrados no alívio e minimização dos sintomas dos doentes. Nestes 22 anos que decorreram desde a descoberta do gene, a comunidade científica tem também concentrado esforços na descoberta e desenvolvimento de drogas capazes de corrigir o princípio básico da FQ. A droga ideal seria capaz de não só corrigir a localização errada da proteína mutada, mas também de potenciar a sua função. Apesar da principal função da proteína CFTR ser inquestionavelmente transportar iões Cl-, este canal é também um factor chave na fisiologia e correcto funcionamento dos tecidos epiteliais. Com efeito, a complexa regulação do transporte iónico nos tecidos e órgãos afectados pela FQ inclui outros intervenientes, os quais foram demonstrados ser regulados pela proteína CFTR. Porém, para além da sinalização celular dependente de cAMP, de que depende a activação da CFTR, também a alteração das concentrações intracelulares de cálcio é capaz de activar o transporte de Cl- em vários tecidos. Propõe-se assim que, através da estimulação do transporte de Cl- por vias alternativas às da proteína CFTR, se poderá corrigir pelo menos este aspecto da FQ, pela compensação do deficiente transporte de Cl- nos tecidos afectados, numa abordagem terapêutica designada por terapia de "bypass. Neste contexto, os canais de Cl- activados por Ca2+ (CaCCs) são proteínas extremamente relevantes. Vários estudos demonstraram que, em tecidos onde não há expressão de CFTR ou onde esta proteína está mutada, há uma maior secreção de Cl- dependente de Ca2+. Estas observações levaram à formulação da hipótese de que a regulação das duas vias poderá acontecer dum modo coordenado. Apesar deste tipo de correntes de Cl- activadas por Ca2+ (ICaCC) serem conhecidas há mais de 20 anos, a identidade molecular do CaCC é ainda hoje debatida. Várias proteínas têm sido sugeridas para explicar a ICaCC, mas apenas recentemente o candidato consistente foi encontrado. Quando foi iniciado este trabalho doutoral, a bestrophin 1 (Best 1) era o mais forte candidato a ser o CaCC. No entanto, enquanto os estudos apresentados nesta tese decorriam, três laboratórios independentes finalmente identificaram a proteína anoctamin 1 (Ano 1) como um componente do canal de Cl- activado por Ca2+ usando diferentes estratégias. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como objectivo investigar o papel e a contribuição de duas proteínas descritas como CaCCs na Fibrose Quística: bestrophin 1 (Best 1) e anoctamin 1 (Ano 1). O impacto dessas proteínas na homeostase e função dos tecidos epiteliais afetados pela FQ foi estudado por meio de técnicas bioquímicas e eletrofisiológicas. Na primeira parte deste trabalho utilizou-se um modelo animal de ratinho/murganho nulo para a proteína Ano1 para investigar a contribuição deste canal na fisiologia das vias aéreas. Os resultados obtidos deram-nos novas perspectivas relativamente à contribuição deste canal na doença pulmonar na FQ, nomeadamente para a secreção de Cl- e manutenção de um eficiente transporte mucociliar. A segunda parte desta investigação focou-se na contribuição dos CaCCs na FQ, nomeadamente na elucidação do mecanismo pelo qual é frequentemente observado um aumento de ICaCC em doentes FQ. A expressão das proteínas Ano1 e Bestrophin1, dois candidatos a CaCCs, foi analisada em linhas celulares que expressam estavelmente a proteína CFTR normal (wild-type) ou a versão mutada (F508del-CFTR) que fica retida no RE. Os nossos resultados mostraram que nenhuma das duas proteínas (Ano 1 e Best 1) apresenta uma maior expressão a nível dos respectivos transcritos nas células F508del-CFTR. Assim, concluímos que não são as alterações na expressão de CaCCs que justificam o aumento de ICaCC frequentemente observado em doentes FQ. Outra hipótese que investigámos foi a possibilidade de ser a sinalização de Ca2+ que se encontra aumentada alterada em FQ, devido à expressão da proteína F508del-CFTR no RE. Tal, facilitaria o transporte de Ca2+ pois, funcionando como um contra-ião, permitiria o simultâneo transporte de Cl-. As observações incluídas neste estudo contribuem para uma melhor compreensão do modo como a actividade dos CaCCs pode modular (e também é modulada) na Fibrose Quística. Além disso, os resultados aqui incluídos dão novas perspectivas para possíveis abordagens alternativas para superar o defeito básico da FQ (terapias de "bypass"), para benefício ultimo dos doentes FQ.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH / BD / 28663 / 200