Mycotoxins in baby foods and study of its potential genotoxic effects

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010As micotoxinas são metabolitos secundários produzidos por fungos, especialmente dos géneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Alternaria. Actualmente mais de 500 compostos foram identificados como sendo micotoxinas. A contaminação dos alimentos por micotoxinas pode ocorrer de forma directa, por contaminação das culturas agrícolas por fungos toxigénicos, ou de forma indirecta, através da cadeia alimentar. Em geral, as micotoxinas são compostos ubíquos muito estáveis, pelo que a confecção ou transformação industrial dos alimentos per se não é suficiente para eliminá-las. A exposição humana a micotoxinas ocorre principalmente por via oral, através da ingestão de alimentos contaminados apesar de, poder ocorrer também por inalação de esporos contaminados ou por via dérmica. Uma vez exposto a micotoxinas, o organismo humano pode vir a desenvolver doenças (micotoxicoses) agudas que podem levar à morte, ou crónicas que podem provocar, entre outras condições, supressão imunológica, défice de crescimento e desenvolvimento de cancro. A severidade da micotoxicose depende sempre das condições fisiológicas do indivíduo, assim como da sua idade, sexo e hábitos alimentares. As principais micotoxinas conhecidas são as aflatoxinas, ocratoxin A (OTA), tricotecenos, zearalenona, alcalóides de Ergot, fumonisinas e patulina. As aflatoxinas são produzidas essencialmente por espécies do género Aspergillus e são principalmente encontradas em culturas de cereais, especiarias e frutos secos, mas também podem ser encontradas em ovos, leite e queijo. As principais aflatoxinas são: B1, B2, G1 e G2. Têm propriedades genotóxicas, citotóxicas, teratogénicas e carcinogénicas, sendo classificadas como “carcinogénicas para humanos” pela International Agency for Research on Cancer (IARC). De facto, a exposição a aflatoxinas constitui um factor de risco para o aparecimento do carcinoma hepatocelular, principalmente quando associada a uma infecção pelo vírus da hepatite B. A aflatoxina B1 (AFB1) é mesmo o maior hepatocarcinogéneo conhecido e tem forte apetência para, uma vez activada por enzimas do citocromo P450, se ligar ao DNA e proteínas formando aductos que, por sua vez produzem respectivamente, mutações e perturbação da função das proteínas afectadas. A aflatoxina M1 (AFM1), que foi objecto do presente estudo, é um metabolito hidroxilado da AFB1 que revela também propriedades carcinogénicas, embora inferiores às da AFB1, sendo classificada pela IARC como um “provável carcinogéneo para humanos”. O seu mecanismo de acção no organismo humano ainda não foi esclarecido, porque tem sido muito menos estudada que a AFB1. A AFM1 tem sido frequentemente detectada em lacticínios, o que faz com que as crianças, grandes consumidores de produtos à base de leite, sejam um grupo especialmente exposto aos seus efeitos adversos. A ocratoxina A (OTA), também focada neste trabalho, é fundamentalmente produzida por espécies do género Aspergillus e Penicillium, tem uma elevada estabilidade e é essencialmente detectada em cereais, café, vinhos e sumos de fruta. É potencialmente nefasta para a saúde humana sendo considerada pela IARC como um “provável carcinogéneo para humanos”, possuindo propriedades nefrotóxinas, hepatotóxicas, imunotóxicas e teratogénicas. A exposição à OTA está associada à ocorrência de tumores no tracto urogenital em populações dos Balcãs, a Nefropatia Endémica dos Balcãs. No que se refere ao seu mecanismo de acção, a OTA interfere com o metabolismo da fenilalanina. Os seus mecanismos de genotoxicidade ainda não são claros, propondo-se que possa causar danos no DNA de forma directa por formação de aductos, ou de forma indirecta por formação de espécies reactivas reactivas de oxigénio. A co-ocorrência de micotoxinas num mesmo alimento tem sido referida em diversos estudos, inclusive a co-ocorrência de aflatoxinas e OTA em alimentos para crianças. A possibilidade de se estabelecerem interacções entre micotoxinas associada ao facto de poder ocorrer potenciação dos seus efeitos nefastos, tem causado preocupação, pelo que têm surgido estudos recentes sobre os efeitos de misturas de micotoxinas. Contudo, face ao elevado número de micotoxinas e à variedade de efeitos, a informação disponível nesta área é ainda muito limitada. A importância atribuída à contaminação dos alimentos por micotoxinas tem-se traduzido no estabelecimento de legislação e criação de entidades reguladoras de forma a implementar um controlo de qualidade alimentar cada vez mais restrito em relação a estas toxinas. A aplicação de tais regulamentos tornou necessário o desenvolvimento e validação de métodos analíticos mais precisos, sensíveis e eficazes. Actualmente a análise por HPLC (High Performance Liquid Chromatography) com detecção por fluorescência é considerado um dos métodos mais usados na detecção das micotoxinas, em particular para as aflatoxinas, daí ter sido escolhido para este estudo. Face aos efeitos das micotoxinas na saúde humana, em particular, a possibilidade da sua co-ocorrência no mesmo alimento e ao facto de as crianças serem uma poulação vulnerável exposta a estes contaminantes através da alimentação, os objectivos deste estudo foram os seguintes: i) o desenvolvimento e validação de um método para a determinação simultânea das aflatoxinas M1, B1, B2, G1, G2 e ocratoxina A em alimentos infantis, ii) aplicação do método validado na determinação destas micotoxinas em alimentos para crianças, leites em pó e cereais (farinhas) para bebés, comercializados em Portugal; iii) a avaliação de potenciais efeitos citotóxicos e genotóxicos da combinação de AFM1 e OTA, comparativamente aos seus efeitos individuais, num modelo celular do epitélio intestinal, as células Caco-2. Com vista à determinação simultânea das aflatoxinas M1, B1, B2, G1, G2 e OTA utilizou-se a extracção das toxinas em colunas de imunoafinidade e análise por HPLC (High Performance Liquid Chromatography) com detecção por fluorescência e derivatização pós-coluna com sistema Kobra-cell. Para avaliação de efeitos citotóxicos e genotóxicos das misturas de AFM1 e OTA utilizou-se, respectivamente, o ensaio do vermelho neutro e o ensaio do cometa em células Caco-2. Após o estabelecimento preliminar do intervalo de concentrações a estudar avaliou-se o efeito citotóxico e genotóxico de AFM1 e OTA, individualmente e em mistura, e analisou-se a possibilidade da existência de interacções no efeito conjunto das duas toxinas. No que se refere à validação da metodologia analítica desenvolvida para a detecção das micotoxinas, foram avaliados os parâmetros de selectividade/especificidade, linearidade/gama de trabalho, limiares analíticos, precisão e exactidão. Todos os parâmetros de validação mostraram-se dentro dos critérios de aceitação. O método demonstrou uma boa linearidade e uma gama de trabalho bem definida, assim como uma boa precisão e exactidão. Não foram quantificadas aflatoxinas nem ocratoxina A nas oito amostras de alimentos para crianças analisadas (4 leites e 4 cereais). Foram detectados vestígios (níveis inferiores ao limite de detecção) de AFM1 em todos os leites em pó analisados e nas amostras de cereais com leite na sua composição. Quanto à presença de AFB1, foi detectada numa amostra de leite e em duas amostras de cereais da mesma marca, também em níveis inferiores ao limite de detecção. Este último caso é particularmente preocupante, visto não existir regulamentação relativamente à existência de AFB1 em fórmulas infantis. As restantes aflatoxinas e OTA não foram detectadas nestas amostras. Relativamente ao estudo da viabilidade das células Caco-2 em presença da OTA e da AFM1 em separado, observou-se que um período de exposição de 48h à OTA produziu efeitos citotóxicos mais consistentes, obtendo-se uma clara relação dose-resposta, a partir da qual foi possível determinar o valor de IC50 (valor ao qual a população celular é reduzida para 50%) de 16,98 μM. A AFM1, por sua vez não demonstrou ter efeitos nefastos na viabilidade celular após 48h de exposição às concentrações testadas. Quando em combinação, estas toxinas revelaram indícios de interacção. A combinação de 2,5 μM de OTA e 0,5 μM de AFM1 provocou um decréscimo da viabilidade celular superior ao esperado pela soma dos efeitos citotóxicos dos respectivos tratamentos individuais, o que sugere a existência de um possível sinergismo. Por outro lado, a combinação de 10 μM de OTA e 1 μM de AFM1 revelou efeitos na viabilidade celular inferiores à soma dos respectivos tratamentos individuais, sugerindo um possível antagonismo.Ambas as toxinas, individualmente ou em mistura (nas mesmas combinações testadas no ensaio do vermelho neutro), não provocaram danos significativos no DNA, como se observou através do ensaio do cometa. Em futuras abordagens será considerado o uso das enzimas específicas no ensaio do cometa, de forma a conferir maior sensibilidade para detectar danos oxidativos no DNA e assim, possivelmente se obter resultados mais significativos. Considerando que as crianças baseiam a sua alimentação em leite e derivados, farinhas e cereais e que são muito vulneráveis a efeitos tóxicos, os resultados deste estudo, ao revelarem a ocorrência de AFM1 nalguns alimentos infantis (em doses muito baixas) e ao sugerirem que a combinação de AFM1 e OTA pode ter efeitos interactivos ao nível da toxicidade, vêm reforçar a relevância desta problemática. Por outro lado, alertam também para a necessidade de se avaliar a exposição das crianças a estes agentes de forma a possibilitar uma completa avaliação de risco.Contamination of foodstuffs with mycotoxins, such as aflatoxins (AF) and ochratoxin A (OTA), causes great health concern. Previous studies reported the co-occurrence of those mycotoxins in baby-foods, however data on the combined genotoxic are limited. The objectives of this study were: i) to develop and validate a method for simultaneous determination of aflatoxins M1, B1, B2, G1, G2 and OTA, ii) to study its occurrence in baby foods marketed in Portugal and iii) to investigate whether a combined intake of the AFM1 and OTA would promote interactive cytotoxic/ genotoxic effects. A method based on immunoaffinity column cleanup and High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection, was developed and validated. The validation parameters analysed included linearity and working range, analytical limits, precision and accuracy and were all within the acceptance requirements. Its application to various baby-food samples showed that no mycotoxins were quantified in the analysed samples however traces of AFM1 and AFB1 were present in some baby foods. As to the individual and combined cytotoxic and genotoxic effects of AFM1 and OTA, they were characterized in Caco-2 cells using the Neutral Red and the Comet assays, respectively. A dose-dependent cytotoxicity was observed for OTA but not for AFM1. Only one (2.5μM OTA/0.5μM AFM1) of the six combinations tested, led to a significantly increased cytotoxicity as compared to the single toxins, suggesting a synergistic effect. On the other hand, any induction of DNA damage was found, neither for individual toxins nor for the mixtures. In conclusion, these data raise the possibility of an interactive effect between the lowest doses of OTA and AFM1, i.e., those that are closer to realistic doses that can be reached in children through diet. Thus, the toxic effects of mycotoxins mixtures might pose a newly identified risk for public health, which deserves further investigation