Host-parasite interactions mediated by toll-like receptors in malaria liver infection

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011Malaria is one of the most severe human infectious diseases, affecting 5 to 10% of the world's population every year. Although malaria eradication has emerged as a desirable if audacious goal, it is consensual that the development of novel intervention strategies is limited by our current understanding of the biology of Plasmodium, the causative agent of malaria, and of the complex relationships that the parasite maintains with its hosts. Plasmodium has a complex life cycle that oscillates between a mosquito vector and a vertebrate host. Upon infection of its mammalian host, each Plasmodium sporozoite establishes itself in liver hepatocytes where it replicates into thousands of new parasites (merozoites) that are subsequently released into the bloodstream, infecting red blood cells and causing malaria. Liver infection by Plasmodium is an ideal target for the development of anti-malaria strategies, as it is the first step of infection and it is clinically silent. Indeed, Plasmodium liver stage is the epitome of a perfect malaria vaccine or drug target since complete protection from infection of the treated human host abrogates clinical manifestation and, importantly, transmission of the disease. Thus, understanding the key events during liver infection will certainly facilitate our progress towards novel intervention strategies against malaria. The prime challenge for any invaded host is to detect the pathogen and orchestrate a rapid defensive response. A set of essential surface and endosomal molecules that comprise the Toll or Toll-like family of receptors perform this role in invertebrate and vertebrate organisms, reflecting a remarkable conservation of function. Functional analysis of mammalian Toll-like receptors (TLRs) has revealed that they recognize specific evolutionarily conserved microbial molecules or molecular families that are present among pathogens and are usually critical to the pathogen's function. These molecules are not found in mammals except in cell stress and inflammation, making them crucial targets for immune intervention. The members of the TLR family recognize lipids, proteins, lipoproteins, carbohydrates, peptides, lipopeptides and nucleic acid structures that are broadly expressed by specific groups of pathogens, providing the basis for innate immunity and ensuring multiple mechanisms of the adaptive immune response against parasites. Although it is clear that pathogen detection involves members of the TLR family and that hepatocytes express the majority of all known TLRs, our current understanding about their function in the innate response to Plasmodium liver infection remains elusive. The work presented in this thesis aimed to determine the role of some of these innate receptors and their adaptor molecule, MyD88, not only in the establishment of Plasmodium in the liver but also during an immunization process with attenuated forms of Plasmodium sporozoites. Liver stage infection by Plasmodium is strongly affected by manipulation of TLR4 and TLR9. While TLR2-deficient mice are infected as wild-type control mice, TLR4 and TLR9-deficient mice show increased susceptibility and resistance to liver stage infection, respectively. While TLR4 absence dampens the inflammatory response, increasing the parasite load in the liver, the lack of TLR9 seems to be detrimental for the parasite. On the other hand, administration of LPS and CpG (TLR4 and TLR9 ligands, respectively), at the time of sporozoite injection, strongly reduces the levels of Plasmodium liver load. In humans, immunization with large numbers of radiation-attenuated sporozoites (RAS) remains the only protocol that leads to the induction of sterile immunity. MyD88 is a mediator of protective immunity induced by P. berghei RAS, despite the fact that when injected with viable sporozoites, MyD88-deficient mice are infected as normal wild-type control mice. Altogether, the findings presented herewith suggest that TLRs not only mediate major events in the establishment of Plasmodium liver stage infection but are also key players during the establishment of sterile immunity.A malária constitui uma das doenças infecciosas mais devastadoras, afectando actualmente 5 a 10% da população mundial. O audacioso plano de erradicação da malária é um objectivo em curso que requer o desenvolvimento de novas estratégias de combate à infecção e que é limitado pelo conhecimento insuficiente da biologia do Plasmodium, o parasita que provoca a malária, e das complexas interacções que mantém com o hospedeiro. O Plasmodium é um organismo protozoário com um ciclo de vida complexo que envolve um mosquito vector do género Anopheles e um hospedeiro vertebrado. A fase hepática da malária é a primeira etapa do ciclo de vida do parasita no hospedeiro mamífero, durante a qual não é revelado nenhum sintoma da doença. É, no entanto, nos hepatócitos que o Plasmodium se desenvolve e replica originando milhares de novos parasitas que são depois libertados na corrente sanguínea. A passagem do parasita para o sangue dará lugar à fase sintomática da doença. Assim, apesar de ser clinicamente silenciosa, a infecção do fígado pelo Plasmodium é determinante no estabelecimento de qualquer infecção de malária. A fase hepática da malária constitui um excelente alvo para a criação de uma vaccina ou de novas abordagens terapeúticas uma vez que conferirá protecção completa ao hospedeiro humano, impedindo a manifestação clínica de sintomas e, mais importante, a transmissão da doença para outros indivíduos. A compreensão dos mecanismos fundamentais de controlo da infecção no fígado irá certamente contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de combate à infecção. Considerando que as terapias existentes actualmente tenderão a tornar-se insuficientes ou obsoletas, devido em grande parte ao desenvolvimento de resistências pelo parasita, será crucial produzir vacinas eficazes contra a infecção por Plasmodium. O principal desafio para qualquer hospedeiro é o de detectar o parasita e de induzir uma resposta defensiva rápida. Os Toll e os Toll-like receptors (TLRs) constituem uma família de receptores do sistema imune inato, que desempenham esse papel essencial de reconhecimento e defesa contra agentes infecciosos. Estão presentes tanto em organismos invertebrados como vertebrados, reflectindo uma notável conservação de função em termos evolutivos. A análise funcional dos TLRs dos mamíferos revelou que estes reconhecem moléculas ou famílias moleculares específicas conservadas evolutivamente que se encontram presentes em microrganismos. Estas moléculas não são encontradas em mamíferos, excepto em condições de stress celular ou inflamação, tornando-as alvos importantes no desenvolvimento de novas estratégias de intervenção imunológica. Os diferentes membros desta família de receptores reconhecem lípidos, proteínas, lipoproteínas, carbohidratos, péptidos, lipopeptídeos e estruturas de ácidos nucleicos que são na generalidade expressas por grupos específicos de organismos patogénicos. Quando reconhecidas pelos TLRs, induzem a activação da imunidade inata, assegurando a geração de uma resposta imune adaptativa contra os parasitas. Actualmente, embora seja consensual a noção de que os TLRs estão envolvidos na detecção de parasitas, e tendo sido previamente descrito que os hepatócitos expressam os TLRs 1 a 9, a nossa compreensão acerca da sua função na resposta imune inata contra a infecção do fígado pelo Plasmodium ainda é limitada. O trabalho apresentado nesta tese focou-se essencialmente na determinação do papel de alguns destes receptores e de uma molécula adaptadora envolvida na via de sinalização dos mesmos, MyD88, durante a fase hepática da malária. Enquanto que a infecção de ratinhos mutantes para TLR2 por esporozoítos de P. berghei – a forma invasiva transmitida por mosquitos Anopheles e que infecta hepatócitos de roedores – é semelhante à dos ratinhos controlo wild-type, a infecção de ratinhos que não expressam os receptores TLR4 e TLR9 apresenta diferenças significativas importantes relativamente aos controlos. Ratinhos com deficiências na expressão de TLR4 e TLR9 revelam uma maior susceptibilidade e resistência, respectivamente, à infecção do fígado pelo parasita. A expressão reduzida ou ausência de TLR4 reduz a intensidade da resposta imune, permitindo uma maior proliferação do parasita no fígado. Pelo contrário, a ausência de expressão de TLR9 parece ser prejudicial para o parasita, uma vez que os níveis de infecção pelo parasita são reduzidos em mutantes para TLR9. Estas observações sugerem que estes dois receptores desempenham papéis importantes na infecção pela forma hepática de P. berghei. De facto, o tratamento com LPS e CpG, ligandos de TLR4 e TLR9 respectivamente, em simultâneo com a infecção, provoca uma diminuição nos níveis de infecção no fígado. O receptor TLR9 poderá ser importante na infecção e desenvolvimento do parasita durante a primeira fase do seu ciclo de vida no hospedeiro. Adicionalmente, a molécula recrutada por todos os TLRs na sua via de sinalização, MyD88, é aqui descrita como mediadora da imunidade protectora induzida por esporozoítos de P. berghei atenuados por irradiação, a única forma até agora descrita de imunização efectiva contra a forma hepática do parasita. Embora a molécula adaptadora MyD88 seja relevante no processo de imunização com esporozoítos irradiados, os ratinhos que não expressam MyD88, quando injectados com parasitas viáveis, revelam níveis de infecção muito semelhantes aos ratinhos controlo wild-type. Os resultados apresentados nesta tese sugerem que os TLRs são mediadores de interacções entre o parasita e o hospedeiro durante a fase hepática da malária e poderão ainda estar envolvidos no desenvolvimento de imunidade conferida pela imunização com esporozoítos irradiados. A activação destes receptores na fase inicial da infecção poderá ainda ditar o grau de desenvolvimento da patologia em etapas mais tardias da doença, e consequentemente, determinar o aparecimento ou a ausência de malária cerebral, a manifestação mais letal desta doença.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); Fundação Calouste Gulbenkian (FCG