Exploring the role of the Jumonji/ARID1 family of proteins during embryonic stem cell differentiation and X-chromosome inactivation

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A inactivação do cromossoma X (XCI) ocorre nas fêmeas de mamífero e serve para compensar o desiquilíbrio do número de genes expressos, entre fêmeas que contem dois cromosomas X e machos que contêm apenas um X e um cromosoma Y (com aproximadamente 10x menos genes). Este processo de silenciamento é um dos exemplos mais dramáticos de fenómenos epigenéticos em mamíferos. Em ratinho, XCI ocorre em duas fases durante o desenvolvimento: inactivação do cromosoma X paterno (a que se chama “imprinting”) no embrião durante a fase depre-implantação e nos tecidos extraembrionários; no estado de blastocisto nas células que darão origem ao embrião ocorre a reactivação do X paterno inicialmente, seguido de uma escolha aleatória entre os dois cromosomas X a ser inactivado [Takagi; 1975] [Okamoto; 2004]. Vários estudos mostraram que o processo de XCI pode ser espontaneamente racapitulado em células estaminais embrionárias (ESC) de ratinho. Estas possuem ambos os cromossomas X activos e, quando sujeitas a diferenciação, um dos X torna-se inactivo [Heard; 2006]. XCI é iniciada com o aumento da expressão, no Xi, de um RNA não codificante – Xist – que se espalha ao longo do cromossoma (em cis) formando um domínio silenciador. RNA PolII é excluida e algumas modificações pos-transcripcionais nas caudas amino-terminais das histons, que são características da eucromatina são perdidas, como H3K4me2/me3 e acetilação das histonas H3 e H4. De seguida, são recrutados complexos repressivos (PRC1 e PRC2) e depositadas marcas de repressão, tais como H3K27me3, H3K9me2, HAK20me1 e H2Aub. Eventos mais tardios, como o recrutamento de macroH2A e a metilação do DNA nos promotores dos genes do cromosoma X, contribuem para a manutenção do estado inactivo do Xi [Chow; 2009] (Fig.1). Apesar de muitos avanços terem sido feitos no estudo da XCI, os mecanismos exactos para o silenciamento génico permanecem por explicar. Neste trabalho, tentámos explorar as alterações dos estados de metilação da histona 3 lisina 4 e metilação de H3K27me3 no contexto de XCI. A perda de metilação na H3K4 é um dos primeiros eventos a ocorrer na XCI. Apesar do mecanismo molecular envolvido nestas alterações ser desconhecido, a rápida perda de H3K4me2/3 sugere o envolvimento de demetilases que removem estas marcas. Proteinas da família Jumonji/ARID1 – JARID1A, JARID1B e JARID1C – foram já identificadas como demetilases específicas para H3K4me2/3 [Christensen; 2007]. Devido à sua estrutura proteica e ao facto de desempenharem funções essenciais no desenvolvimento e controlo da divisão celular, são consideradas boas candidatas para o papel de demetilases de H3K4 no processo de XCI. Contrariamente a H3K4me2/3, H3K27me3 é uma modificação pós-transcripcional repressiva da cauda amino-terminal da histone H3. H3K27me3 é depositada na histona H3 pelo complexo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) e reconhecida pelo complexo PRC1, que promove a ubiquitinação de H2AK119 e consequente condensação da cromatina [Kingston; 2010]. Ambos os complexos repressivos PRC1/2 estão presentes no cromossoma Xi. No entanto, o mecanismo pelo qual são recrutados está ainda por esclarecer (Silva et al., 2003). Recentemente, 5 estudos independentes identificaram a proteina JARID2 - da família Jumonji/ARID1 - como parte do complexo PRC2 [Shen; 2009] [Peng; 2009] [Pasini; 2010] [Li; 2010] [Landeira; 2010]. No entanto, estudos funcionais geraram resultados bastante conflituosos relativamente ao papel do JARID2 na actividade de metiltransferase de PRC2 e na regulação dos níveis de H3K27me3 nos genes alvo. Devido à sua associação com PRC2, e possível interação com PRC1 [Eberl, resultados não publicados], JARID2 potencialmente poderá ter um papel chave no recrutamento destes complexos para o cromossoma X durante XCI." Para explorar o papel destas proteinas, da família Jumonji/ARID1, durante a diferenciação e no contexto da XCI, transfectámos ESC femininas com BACs contendo um dos quatro genes com GFP fundido na extremidade carboxil (JARID1A/B/C e JARID2). Foram obtidas ESC transgénicas para todos eles excepto JARID1A, devido a um erro na inserção da GFP motivado pela incorrecta anotação do gene. Este poderoso sistema, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos localizar proteinas em ESC e descrever a sua cinética durante a diferenciação e XCI. Explorar o papel das demetilases de H3K4 na biologia das ESC e na XCI A análise dos padrões de expressão de JARID1B e JARID1C em ESC (não diferenciadas) condosiu-nos a um resultado bastante interessante. Em ESC, JARID1B-GFP (e JARID1B endógeno) e JARID1C-GFP apresentam uma expressão heterogénia. Curiosamente, a expressão de JARID1B, mas não a de JARID1C, está correlacionada negativamente com os níveis de H3K4me2/3 na célula. Células que expressam muito JARID1B apresentam baixos níveis de H3K4me2/3 e vice-versa. Estes dados sugerem que os níveis de expressão de JARID1B determinam os níveis globais de H3K4me2/3 em ESC. Estudos funcionais, tais como knock down (KD) ou knock out (KO) (trabalho em colaboração) e sobre-expressão de JARID1B (através dos clones JARID1BGFP) podem ser realizados para tentar explorar o impacto de JARID1 e dos níveis de metilação de H3K4 em ESC. Na tentativa de perceber a razão para este mosaicismo, testamos a hipótese da expressão de JARID1B estar correlacionada com o ciclo celular ou ser dependente de factores de pluripotência, como NANOG e OCT4. Os resultados preliminares obtidos (live cell imaging e imunoflorescência) não suportam nenhuma destas hipóteses. A possibilidade da variação na expressão de JARID1B ser estocástica numa população de ESC é, para nós, a mais aceite [Roesch; 2010]. De seguida fomos investigar se JARID1B-GFP e JARID1C-GFP são recrutados para o cromossoma X, durante XCI. Os nossos resultados mostraram que estas proteinas não são recrutadas para o Xi e são perdidas com uma dinâmica semelhante à perda de H3K4me2 , quando analisado por técnicas de IF/RNA FISH. No entanto, o seu papel na demetilação de H3K4 durante a XCI não pode ser para já excluido, pois a sua associação com a cromatina pode ser apenas transiente ou decorrer noutra altura do processo de inactivação. Técnicas como ChIP e ChIP-seq nos clones GFP-tagged permitir-nos-ão verificar com mais precisão se estas proteinas interactuam com alguma região do cromossoma X. Explorar o papel de JARID2 na metilação de H3K27 durante a XCI Neste trabalho, observamos pela primeira vez JARID2 ser recrutado para o Xi, durante o processo de XCI. O recrutamento tem início no 1º dia de diferenciação, é máximo no 2º dia e diminui ao 4º e 6º dias. Para perceber se JARID2 está envolvido nas funções dos complexos repressivos PRC1 e PRC2 durante a XCI, foi feita uma análise comparativa das suas cinéticas de recrutamento para o Xi. A nossa análise mostrou que JARID2 e EED (membro do PRC2) estão presentes aproximadamente no mesmo número de domínios, enquanto que RING1B (membro do PRC1) é observado apenas numa pequena fracção dos domínios. No entanto, uma análise mais detalhada em que observamos JARID2 e EED simultaneamente, mostra que a cinética de recrutamento destas duas proteinas é diferente. JARID2 atinge o seu nível máximo no 2º dia de diferenciação e decresce ao 4º dia, enquanto que EED não atinge um nível tão elevado ao 2º dia e permanece inalterado ao 4º dia. Outro resultado bastante interessante é o facto dos níveis de H3K27me3 aumentarem quando JARID2 diminui e PRC2 se mantem no Xi. Estes resultados apoiam em parte um modelo proposto no artigo [Peng; 2009]: JARID2 após ser recrutado para o Xi, possivelmente por ligação ao Xist RNA, iria promover a ligação de PRC2. Este, em complexo com JARID2, teria a sua actividade enzimática inibida e só se tornaria totalmente funcional (na trimetilação de H3K27) quando JARID2 é perdido do Xi. Estudos funcionais, com o objectivo de explorar a possível interdependência entre JARID2 e PRC2 no processo, já começaram a ser desenvolvidos com a criação de ESC KD para Jarid2 e ESC KD para Suz12 (membro do PRC2). Neste trabalho os BACs alterados com a inserção de GFP foram utilizados em experiências de localização de proteinas em celulas fixas e vivas. Além disto, as linhas celulares com BACGFP podem ser utilizadas para estudos de espectometria de massa para identificar complexos proteicos em que estão envolvidos e também para ChIP ou ChIP-seq para identificar os genes alvo destas proteinas [Poser; 2008]. Isto permitirá comprender melhor as funções destas proteinas em ESC e também na XCI se tiverem uma função nesse processo.X-Chromosome Inactivation (XCI) in female mammals results in transcriptional silencing of one of the two X-chromosomes to attain gene dosage parity between females and males. We studied the mechanisms responsible for the changes on the methylation states of two residues on histone 3 that occur in the early phase of XCI: the loss of an euchromatic mark, H3 Lysine 4 di- and tri-methylation (H3K4me2/3) and the gain of a repressive mark H3K27me3. The fast loss of the H3K4me2/3 marks suggests the involvement of histone demethylases of the Jumonji/ARID1 family, such as JARID1B and JARID1C. Another protein from the same family but with no demethylase activity JARID2 was described to interact with the H3K27me3 methyltransferase complex called PRC2 and important for its recruitment to chromatin, being an important candidate for the mechanism of H3K27me3 deposition. To assess the potential association of these proteins in XCI, we created mouse XX embryonic stem cells (ESC) with BACs, containing these proteins fused to GFP to allow us to track protein localization in ESCs and describe their kinetics during XCI. We observed that JARID1B, but not JARID1C, may be a crucial H3K4 demethylase in ESC cells. JARID1B and C do not seem to be recruited to the Xi repetitive core, but a transient association to specific regions should not be discarded. In contrast, JARID2 was seen being recruited to the Xi. By comparing JARID2 and PRC2 kinetics of recruitment, we propose a model whereby JARID2 at the Xi would recruit PRC2. PRC2 enzymatic activity would stay inhibited and, only after JARID2 depletion from the Xi, it would be able to fully tri-methylate H3K27. The use of these BAC-GFP cells lines generated, in conjunction with knockdown strategies, will highlight the role of those proteins in the context of XCI