Functional characterization of lon channels with a crucial role in cystic fibrosis : regulation of epithelial Na+chanel (ENaC) and Ca2+-activated Cl- channels (CaCCs) in epithelial cells

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disease leading to a progressive major pulmonary dysfunction and caused by mutations in the gene encoding the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) protein, which, in CF, has impaired function and/or expression. CFTR is an ABC-transporter expressed at the apical membrane of epithelial cells where it functions as a cAMP-dependent, PKA-regulated Cl- channel. In turn, CFTR also regulates other ion conductances such as the epithelial Na+ channel (ENaC) which is inhibited by CFTR. This leads to a major characteristic of CF epithelia, i.e., defective CFTR-mediated Cl- secretion and enhanced Na+ absorption. Traditional CF therapies treat the symptoms. However, several different therapeutic approaches for the treatment of the basic defect in CF are being pursued. In addition to “CFTR-assist” strategies aiming at correct the intrinsic defect of multiple CFTR mutations, others such as inhibition of ENaC and/or activation of alternative Clchannels, e.g. Ca2+-activated Cl- channels (CaCCs) may be able to partially by-pass and overcome the defects caused by the loss of CFTR. The feasibility of these non- CFTR based approaches requires a better knowledge of the characteristics and regulation of the ion channels in question, so that a normally hydrated epithelial surface can be maintained and soften CF lung disease severity. The mechanism(s) through which CFTR controls ENaC activity remain elusive. Several proteins have been suggested to mediate CFTR-ENaC functional interaction and to have a differential effect on ENaC activity depending on the presence or absence of wild type CFTR protein. One of the proposed mediators is the casein kinase 2 (CK2), previously shown to phosphorylate - and -ENaC subunits, and whose localization at the apical membrane of epithelial cells is abolished when the most common CFTR mutation in CF is present. In Chapter 1 on the Results section, the effects of CK2 phosphorylation on ENaC activity and expression were addressed in detail. We found that basal CK2 phosphorylation of ENaC C termini keeps the channel active and impairs the binding of the ubiquitin ligase Nedd4-2, inhibiting channel endocytosis. In Chapter 2 of the Results section, another kinase affecting CFTR and ENaC activity, the AMP-dependent protein kinase (AMPK), was investigated. AMPK is activated upon ATP depletion in the cells, switching off ATP-consuming pathways, such as those that lead to ion transport through ENaC and CFTR. Here, the mechanism by which AMPK controls ENaC activity and its physiological relevance in a knockout mouse model for the catalytic subunit of AMPK. We observed that AMPK activation stimulates Nedd4-2- dependent ENaC endocytosis and consequent inhibition of Na+ transport that is coupled to ATP consumption through the activity of Na+/K+-ATPase. Knockout animals have increased expression of ENaC at the apical membrane of different epithelia as well as enhanced Na+ transport in these tissues. Regulation of ENaC by AMPK differs from that mediated by CK2 in the way that while the last occurs constitutively, the former is most relevant under stress conditions and energy depletion. The fact that both CK2 and AMPK are ubiquitously expressed and have many cellular targets questioned their use as therapeutic targets in CF and evidenced the urge for the identification of novel ENaC regulators. This was performed using high-content screening microscopy and human siRNA libraries and these data are presented in Chapter 3 of the Results. The screen resulted in the identification of 174 different genes whose products activate ENaC that constitute potential targets for ENaC inhibition and treatment of CF lung disease. In the absence of CFTR, movement of Cl- ions across epithelial surfaces procedes through Ca2+-activated Cl- channels (CaCC) which, under such conditions become crucially important for the maintenance of a normal ionic balance. This is evidenced in CF mouse models that fail to exhibit the lung disease observed in humans, most probably due to the high CaCC activity which, in murine airways, serves as the main pathway for Cl- transport. Although the biophysical properties that characterize CaCC are well established for long, the molecular identity of these CaCCs was only recently identified as being the TMEM16 (anoctamin) protein family. As bestrophins, whose expression correlate well with Ca2+-activated Cl- currents, could also play a role in CaCC conductance, we investigated them in Chapter 4 of the Results. We observed that Bestrophin 1 (Best1) is localized in the endoplasmic reticulum (ER) membrane and we propose that its function is to conduct Cl- as the counteracting ion for the movement of Ca2+ into and out of the ER. Best1 thus allows proper signaling by Ca2+ and facilitates Ca2+-dependent ion conductance in epithelial cells. Finally, in Chapter 5 of the Results section, data are included on the role of TMEM16 proteins on different important cellular properties, such as the regulation of the cell volume after a hypotonic shock and cell swelling. We showed that the ability of the cells to recover their initial volume after swelling depends on the activity of TMEM16A and other members of this family, in a process that requires ATP release and binding to purinergic receptors. Altogether, these data bring new insights into the expression and regulation of two types of channels of very high relevance to the Cystic Fibrosis field, ENaC and CaCCs, which may be crucial for the development of “by-pass therapies”, i.e. those aiming at overcoming the ionic defects caused in epithelia by the loss of CFTR.A Fibrose Quística (FQ) é a doença genética autossómica recessiva mais comum na população Caucasiana. Esta doença é causada por mutações no gene que codifica a proteína CFTR (do inglês: Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que conduzem à sua perda de função e expressão correctas. A FQ é caracterizada por uma obstrucção pulmonar crónica devido a infecções bacterianas recorrentes, sendo esta a principal causa de mortalidade. Outros sintomas típicos da doença incluêm insuficiência pancreática, aumento da concentração de sódio e cloreto no suor e infertilidade masculina. No pulmão dos doentes com FQ, a composição iónica alterada do líquido que reveste as vias respiratórias dificulta o transporte mucociliar e leva à acumulação de um muco espesso, propício à colonização por bactérias, em particular Pseudomonas aeruginosa. Estas infecções bacterianas e o processo inflamatório que daí resulta, geram um ciclo vicioso que conduz à perda progressiva da função pulmonar e à morte precoce do doente. Até à identificação da causa molecular da doença, a determinação da concentração salina no suor (elevada na FQ) era praticamente a única ferramenta de diagnóstico, continuando ainda a ser o método mais usado para diagnosticar a doença. O CFTR funciona como um canal de iões cloreto (Cl-) na membrana apical das células epiteliais, activado pelo cAMP e por fosforilação pela proteína cinase A (PKA). A proteína CFTR, composta por uma única cadeia polipeptídica com 1.480 resíduos de aminoácidos, pertence à vasta família de transportadores celulares que são responsáveis por facilitar a passagem de diversas substânicas através de membranas das células. Este processo requer energia pelo que é acoplado à hidrólise de ATP, sendo os membros desta família designados por transportadores ABC (do inglês: ATPbinding cassette). Porém, o CFTR é o único transportador ABC que funciona como um canal iónico. O CFTR regula também outros canais iónicos presentes na membrana plasmática, sendo bastante relevante na FQ o efeito inibitório que as correntes de Cl- através do CFTR têm na activade do canal epitelial de sódio (do inglês: Epithelial Sodium Channel ou ENaC). Deste modo, a doença pulmonar na FQ deve-se, não só à existência de uma secreção de Cl- ineficiente mas, também, a uma absorção excessiva de sódio (Na+) devido à hiperactividade do ENaC nos tecidos dos pacientes. Como já foi referido, o ENaC é um canal de sódio, constituído por três subunidades diferentes, -, - e -ENaC, que oligomerizam e formam um canal funcional. Para além da relevância desta proteína no contexto da FQ, mutações nas suas cadeias polipeptídicas estão também relacionadas com diferentes formas de hipertensão. Várias abordagens terapêuticas para o tratamento da FQ têm sido desenvolvidas e testadas nos pacientes. Porém, a elevada complexidade desta doença requer, muitas vezes, a combinação de diferentes estratégias, não existindo ainda cura para a doença. As duas abordagens mais relevantes para esta tese de doutoramento basearam~se na tentativa de mimetizar e ultrapassar os problemas causados pela falta do CFTR na membrana apical do epitélio pulmonar. Particularmente, tem-se depositado grande esperança em compostos que levem à inibição do ENaC ou à activação de outros canais de Cl- (como os canais de Cl- activados pelo Ca2+ ou CaCCs). Porém, a utilidade destas estratégias terapêuticas requer o conhecimento e melhor compreensão das características e mecanismos de regulação dos canais iónicos em questão, para que seja possível criar uma superfície pulmonar hidratada e aliviar os sintomas pulmonares observados na FQ. Os mecanismos que levam à inibição do ENaC pelo CFTR não estão ainda completamente esclarecidos, embora muitas proteínas já tenham sido propostas como possíveis mediadoras da interacção entre o CFTR e o ENaC. Estas teriam um efeito diferente na actividade do ENaC consoante estivessem na presença de um canal CFTR funcional ou de uma proteína mutada. Uma destas proteínas é o cinase de caseína 2, também conhecido por CK2 (do inglês: casein kinase 2), cuja ligação ao ENaC e utilização do mesmo como substrato do cinase tinham sido previamente demonstradas. A localização da CK2 na membrana plasmática das células só é detectada quando a proteína CFTR wild-type está presente. O efeito da fosforilação pela CK2 na actividade e expressão do ENaC foram analisados em detalhe e constituem o tópico principal do Capítulo 1 da tese. Descobrimos que a fosforilação basal pela CK2 de dois resíduos nas extremidades COOH das subunidades - e - do ENaC mantêm o canal activo e impossibilita a ligação, e consequente ubiquitinação, de um ligase de ubiquitina E3 conhecido como Nedd4-2, inibindo deste modo a endocitose do ENaC. Um outro enzima que afecta, simultaneamente, tanto a actividade do CFTR como a do ENaC é o cinase dependente do AMP (do inglês: AMP-dependent protein kinase AMPK). Este cinase é activado quando as células estão privadas de ATP, catalisando a fosforilação e inibição de uma série de vias metabólicas que consomem ATP, nomeadamente, das que levam ao transporte iónico através do CFTR e do ENaC. O mecanismo pelo qual a AMPK controla a actividade do ENaC, assim como a relevânica fisiológica deste processo foram analisados em oócitos, em linhas celulares epiteliais e em ratinhos cujo gene responsável pela codificação da subunidade catalítica da AMPK não se encontrava funcional. Os resultados destas experiências, apresentados no Capítulo 2, sugerem que activação da AMPK estimula a endocitose do ENaC de uma maneira dependente da actividade da Nedd4-2, levando a uma inibição do transporte de Na+. Os tecidos dos ratinhos que não possuem AMPK funcional expressam mais ENaC na membrana apical, e exibem um transporte mais significativo de Na+. Deste modo, podemos concluir que a regulação do ENaC pela AMPK é distinta daquela efectuada pela CK2 no sentido em que, enquanto esta última ocorre em condições basais, a primeira é apenas relevante numa situação de stress como a falta de energia nas células. Contudo, tanto a CK2 como a AMPK têm uma expressão ubíqua e fosforilam muitas outras proteínas nas células, tornando difícil o uso das mesmas como alvos terapêuticos na FQ e evidenciando a necessidade da identificação de outros reguladores do ENaC. De modo a cumprir este objectivo, realizámos um screen e analisámos por microscopia o efeito de cerca de 20,000 siRNAs na função do ENaC. Deste screen resultaram 174 genes que activam o ENaC e cuja inibição pode ser eficaz para reduzir o transporte excessivo de Na+ que tanto prejudica as vias respiratórias dos pacientes com FQ. Na ausência de CFTR, o movimento de iões no epitélio de superfície decorre através dos canais de Cl- activados pelo Ca2+ (do inglês: Ca2+-activated Cl- channels ou CaCCs) os quais, sob tais condições, se tornam de crucial importância para a manutenção do equilíbrio iónico normal. Esta observação é demonstrada pela inexistência de sintomas de doença pulmonar em ratinhos cujo gene CFTR foi reprimido, contrariamente ao que se observa em humanos, pois os CaCCs são a via mais significativa de saída de Cl- nas vias respiratórias dos ratos. Apesar das propriedades biofísicas que caracterizam os CaCCs serem bem conhecidas e determinadas, só recentemente se descobriu que a entidade na membrana plasmática das células epiteliais responsável por este tipo de correntes pertence à família TMEM16 (ou anoctaminas). Assim sendo, a função de candidatos propostos previamente como CaCCs não era clara, sendo importante esclarecer o papel de uma outra família de CaCCs, as bestrofinas, na secreção epitelial. Estudos anteriores tinham demonstrado a existência de uma correlação entre a expressão de bestrofinas, nomeadamente da isoforma 1 (Best1) e a existência de correntes de Cl- activadas pelo Ca2+. Os resultados que obtivemos sugerem que Best1 está localizada na membrana do retículo endoplasmático, onde funciona como um canal de Cl- sensível ao Ca2+ que contrabalança as cargas negativas deixadas quando da entrada ou saída de Ca2+ deste organelo. Deste modo, Best1 possibilita a sinalização intracelular que usa o Ca2+ como segundo mensageiro e facilita o transporte iónico dependente do Ca2+, tal como é apresentado no Capítulo 4. Para finalizar, o último capítulo (Capítulo 5) aborda a importância das proteínas TMEM16 em diferentes processos celulares, tal como a regulação do volume das células após um choque hipotónico e o aumento do mesmo. Os nossos resultados demonstram que a capacidade que as células têm de recuperar o seu volume inicial após um choque hipotónico depende da actividade de várias membros desta família de proteínas, num processo que requer a libertação de ATP e a ligação do mesmo a receptores de membrana. Em conclusão, os resultados obtidos permitem aprofundar o conhecimento existente sobre a expressão e regulação de dois tipos de canais com elevada importância no campo da FQ, ENaC e CaCCs, sendo este essencial para o desenvolvimento de terapias alternativas para a doença.Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (SFRH/BD/29134/2006