Role of mycobacteria porins and efflux pumps on the intracellular survival within macrophages

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010O género Mycobacterium engloba um grande número de espécies patogénicas e não patogénicas. As espécies patogénicas causadoras de tuberculose e semelhantes geneticamente à espécie M. tuberculosis integram um grupo denominado Complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB). A incidência de tuberculose no mundo é cerca de 8 milhões de casos por ano, prevalecendo em aproximadamente um terço da população humana. A estas estatísticas alarmantes junta-se a ocorrência crescente de estirpes resistentes à terapêutica antibiótica utilizada. Estes factores levaram ao reconhecimento por parte da Organização Mundial de Saúde do problema da tuberculose no mundo e ao crescente esforço para o desenvolvimento de novas estratégias de combate à doença, onde se incluiu o esforço científico para compreender a patogénese da tuberculose, encontrar novos alvos terapêuticos e novos medicamentos. Uma das razões pela qual as bactérias que compreendem o CMTB são tão bem sucedidas na prevalência nos seus hospedeiros é a sua capacidade de permanecerem e se dividirem no interior de um grande número de células imunitárias. No interior dos macrófagos, estas bactérias conseguem suportar e inibir os mecanismos bactericidas, permanecendo em compartimentos fagossomais imaturos. Após a primo-infecção, que ocorre na maioria dos casos através da inalação das bactérias para os pulmões, a resposta imunitária do hospedeiro irá conter a infecção em estruturas denominadas granulomas. Aqui, as micobactérias permanecem de forma latente até que existam condições que propiciem a sua reactivação. No geral, apenas 10% dos indivíduos infectados irá sofrer de tuberculose, na maioria desses casos o prosseguimento da infecção irá dever-se a uma imunodepressão do hospedeiro. De entre as várias estruturas que conferem às micobácterias o seu potencial patogénico destaca-se a sua membrana. Esta membrana é a mais espessa alguma vez descrita, sendo composta por uma membrana interna e uma membrana externa de cerca de 10nm de espessura. Esta espessura leva a uma forte dificuldade na difusão de compostos pela membrana. Por um lado, a membrana é fortemente hidrofóbica, dificultando a difusão de compostos hidrofílicos, por outro lado a sua espessura leva a que mesmo os compostos hidrofóbicos atravessem a membrana muito lentamente. Apesar de este facto levar a uma maior resistência em relação a antibióticos é necessário que o transporte de nutrientes e outros factores necessários para a replicação seja assegurado. Umas das estruturas membranares descritas como importantes para este transporte são as porinas. Estas, são proteínas multiméricas que formam canais aquosos na membrana externa e permitem a passagem inespecífica de água, iões e outras pequenas moléculas. Nas micobactérias, este transporte é descrito como sendo muito ineficiente, e correlacionado com a resistência intrínseca das micobactérias a vários antibióticos e com a sua característica taxa de crescimento lenta. Estudos anteriores descrevem o papel da porina MspA, presente na espécie não patogénica M.smegmatis, no influxo de glucose, e fosfatos, mas também na susceptibilidade a antibióticos e à morte por macrófagos. No seguimento destes estudos foi feito um rastreio em larga escala de genes em M. bovis BCG que pudessem codificar para uma porina com actividades semelhantes em bactérias do CMTB. Na primeira parte desta tese é explorado o papel de uma nova porina, MtpA, conservada entre M.tuberculosis e M. bovis, na sobrevivência intracelular de M. bovis BCG em macrófagos. Para tal, foram analisados vários clones de BCG com mutações no gene mtpA. Em estudos anteriores, ao ser interrompida a expressão do gene mtpA que codifica a porina, foi verificado um aumento da resistência a antibióticos. Ao mesmo tempo já foram encontradas evidências para a sua actividade canal e transporte de glucose. Estudos por parte de M. Niederweis e o seu grupo revelam também que apenas um dos domínios da porina MtpA aparenta ser necessário para a sua actividade canal (domínio 1). A primeira evidência descrita nesta tese é a redução da taxa de crescimento da população de mutantes MtpA. A ausência da porina traduz-se num crescimento lento, provavelmente relacionado com o menor influxo de nutrientes. O crescimento normal é no entanto restabelecido ao complementar a mutação, quer com o domínio 1 de MtpA (d1) quer com a porina MspA de M.smegmatis. Para se compreender o papel de MtpA na sobrevivência intracelular em macrófagos, foram infectadas duas linhas celulares, macrófagos humanos THP-1 e macrófagos de ratinho J774.A1. Foram também infectados macrófagos derivados de monócitos isolados a partir da fracção “buffy coat” de sangue de dadores humanos saudáveis (MDMH). Analisando os perfis de sobrevivência constatou-se que o mutante MtpA era mais resistente à morte intracelular por macrófagos de ratinho (J774.A1) do que o controlo. Pelo contrário, em macrófagos humanos, o controlo tinha a capacidade de replicar intracelularmente aumentando a sua carga bacteriana nos macrófagos enquanto o mutante MtpA não o conseguia (em THP-1) ou então aumentava mais lentamente (MDMH). Ao mesmo tempo, quando foi utilizado interferão-gama para estimular os macrófagos (MDMH e J774.A1) verificou-se que enquanto o controlo sofria uma forte queda da sua sobrevivência o mutante MtpA não apresentava alterações significativas. Isto evidencia um papel da porina MtpA no aumento da susceptibilidade a mecanismos relacionados com interferão-gama. Os macrófagos de ratinho estão descritos por possuírem uma actividade bactericida mais elevada do que os humanos, através da produção de moléculas como o óxido nítrico (NO). É por isso possível que a ausência de MtpA apenas resulte numa vantagem para a sobrevivência nos casos em que a pressão antimicrobiana é elevada, ou seja, em macrófagos de ratinho ou em macrófagos estimulados com interferão-gama. Ao longo destas experiências foi também verificado que o mutante complementado com d1 recuperava sempre o fenótipo de sobrevivência do controlo, comprovando que apenas o domínio 1 da porina é suficiente para restabelecer o seu papel na sobrevivência intracelular. Por outro lado o mutante complementado com a porina MspA apresentou sempre a menor sobrevivência de entre os mutantes estudados. Isto sugere que apesar de MspA poder ser suficiente para complementar a ausência de MtpA e restabelecer o crescimento normal de BCG in vitro, no ambiente intracelular, a porina proveniente de M. smegmatis aumenta severamente a susceptibilidade de BCG aos mecanismos bactericidas dos macrófagos. Para escrutinar a razão pela qual a ausência de MtpA aumenta a sobrevivência de BCG em macrófagos de ratinho e torna a bactéria imune a mecanismos dependentes de interferão-gama, foi analisada a expressão genética de dois genes relacionados com a resposta pró-inflamatória, a interleukina-1 beta (IL-1β) e o indutor do óxido nítrico (iNOS). Verificou-se que em macrófagos infectados com o mutante MtpA, ocorria uma menor indução da transcrição desses dois genes comparativamente ao controlo ou aos mutantes complementados com MtpA completa ou d1. Este resultado sugere que o aumento da sobrevivência pode ser explicado parcialmente pela menor indução da actividade pró-inflamatória. De facto, verificou-se que os macrófagos de ratinho infectados com o mutante MtpA continham níveis inferiores de NO. Em macrófagos humanos, não está descrita a importância do NO na actividade antimicrobiana e por isso, apesar de se verificar que a expressão genética do indutor do óxido nítrico humano (NOS2) também era menor durante a infecção pelo mutante MtpA, não foi possível em qualquer caso detectar qualquer NO. Isto também pode ser uma explicação para o facto de o mutante MtpA ser apenas mais resistente que o controlo em macrófagos de ratinho, já que nas células humanas, as alterações a nível de expressão genética de NOS2 não terão efeitos práticos na capacidade microbicida destes macrófagos. Concluindo esta parte, verifica-se que a porina MtpA é relevante para a sobrevivência intracelular de BCG em macrófagos. MtpA tem um papel no crescimento de BCG aumentando o influxo de nutrientes e permitindo uma mais elevada taxa de divisão. Ao mesmo tempo MtpA também aumenta a susceptibilidade da bactéria a mecanismos microbicidas dos macrófagos. A maior indução de estímulos pró-inflamatórios por parte de bactérias com MtpA poderá indicar que esta porina intervém nos processos de reconhecimento inato de moléculas microbianas. A porina pode estar a ser reconhecida pelos macrófagos ou pode ser uma via de saída de moléculas bacterianas que serão posteriormente reconhecidas por receptores do macrófago. Na segunda parte desta tese é analisado o efeito antimicrobiano de álcoois de cadeia longa. Como foi referido, a membrana das micobactérias e as suas estruturas são grandes responsáveis pela resistência destas bactérias a antibióticos. O surgimento de bactérias resistentes à terapêutica leva à necessidade de novas moléculas com actividade antimicobacteriana. Num estudo anterior foram sintetizados derivados de ácido pirazinóico (POA). O ácido pirazinóico é o metabolito activo de um dos fármacos de primeira linha contra a tuberculose, a pirazinamida (PZA). A PZA é activada em POA por uma única enzima micobacteriana, a pirazinamidase (PZase). Este facto leva a que mutações no gene pncA que codifica a PZase sejam frequentes. Os novos derivados de POA foram desenhados de forma a serem activados por esterases que devido à sua abundância contornam o problema da activação do fármaco. Estas enzimas clivam a ligação éster, o que resulta na libertação de POA e do álcool de cadeia linear usado como adaptador. No entanto, no mesmo estudo, foi verificado que estes novos derivados eram muitos mais efectivos a matar micobactérias do que a própria molécula activa, POA. Para além disso estes compostos eram agora eficazes a matar micobactérias naturalmente resistentes a POA, tal como M.avium e M.smegmatis. Estas últimas possuem mecanismos de resistência dependentes de bombas de efluxo e por isso, apesar de possuírem uma elevada actividade de PZase, são resistentes quer à PZase quer ao POA. O facto de os novos derivados contornarem esta resistência por bombas de efluxo levou à hipótese de ser a restante estrutura, o álcool de cadeia longa, a ser activo contra estas bactérias. Nesta tese é mostrado que os álcoois de cadeias longas possuem elevada actividade micobactericida. Verificou-se que em M. tuberculosis, M. bovis e em M.avium, as cadeias mais longas, com 12, 14 e 16 carbonos são as mais eficazes. Estes álcoois são pouco afectados pelos mecanismos de resistência dependentes de bombas de efluxo de M. avium. Quando testadas em macrófagos infectados, o álcool de 12 carbonos, 1-dodecanol, revelou-se o mais bactericida e menos tóxico para os macrófagos. É assim mostrado, que a utilização de moléculas adaptadoras com características antimicrobianas no desenho de novos fármacos, pode aumentar a sua actividade e circundar mecanismos de resistência. No caso da PZA, a utilização de álcoois de cadeia linear de 12 carbonos acoplados ao POA aumenta o potencial do fármaco no tratamento da tuberculose.The characteristic membrane of mycobacteria and its related components were already implicated in the enhanced persistence and success of pathogenic mycobacteria in their hosts. The porin and efflux pump-content of the membrane dictates the permeability and accumulation of bactericidal compounds, whether being antibiotics or other molecules released by the infected macrophages such as nitric oxide. In the first part of this thesis, the role of newly discovered putative porin MtpA, conserved in M. bovis BCG and M. tuberculosis was addressed. Several mutant clones of M. bovis BCG were tested to elucidate the role of MtpA on intracellular survival inside macrophages. It was determined that absence of the porin enhances intracellular survival in mouse macrophages yet reduces it in human macrophages. It was also observed that the MtpA mutant induced lower activation of pro-inflammatory response in all the macrophages tested and lower production of nitric oxide in mouse macrophages. The described activity of MtpA was found to require only one of its structural domains and could not be complemented using the non-pathogenic M. smegmatis porin MspA. These evidences point for a specific role of MtpA in membrane permeability to bactericidal molecules released by macrophages and also the possibility of this porin being involved in innate immunity recognition of the bacilli. In the second part, the antimicrobial activity of previously described POA-derivates was analyzed. In those prodrugs, POA is linked by an ester bond to a long linear carbon chain. Upon cleavage, POA and a long linear alcohol chain is released. Here is demonstrated that these LLCAs possess bactericidal activity and circumvent POA resistance mechanisms dependent on drug efflux-pumps. In those POA-resistant bacteria, such as M. avium, the antimicrobial activity displayed by the new POA-derivates is owed to the release of the LLACs and not to POA itself