The relationship of ERG potassium channel with programmed cell death in the vertebrate developing limb

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A proper rate of programmed cell death (apoptosis) is vital to maintain normal tissue homeostasis, limit organ growth, eliminate unnecessary cells and undergo normal development. During limb development the apoptotic areas are controlled by a tight interaction between different genes that are responsible for the specific localization of this domains in the limb bud. In here we show that ERG, an outward potassium channel belonging to the ether-a-go-go family of voltage-gated potassium channels, is expressed, in proper time and space, in the apoptotic areas. We have studied the relevance of erg during the apoptotic process during the formation of digits in species with a different pattern of interdigital cell death, namely duck and chicken. We have performed loss-of-function experiments through in ovo electroporation of a construct with specific RNAi against erg and by implantation of beads soaked in an ERG inhibitor. The phenotypes obtained show a decrease in apoptosis in the interdigital space. Moreover, inhibition of erg action is followed by downregulation of different molecules involved in the apoptotic process. We have also unraveled the relationship of erg with different signaling pathways known to be involved in the triggering of cell death during limb development like FGFs, BMPs and Retinoic Acid. Most importantly, our findings show that erg is a key player in the establishment of interdigital cell death during digit development. Our results support a model in which erg is responsible for detachment.Uma taxa de morte celular programada (apoptose) adequada é vital para a manutenção da homeostase dos tecidos, limitação do crescimento celular, eliminação de células indesejadas e para o decorrer normal do desenvolvimento no organismo. O desenvolvimento do membro é uma situação paradigmática em que a morte celular programada tem um papel central na morfogénese (Saunders, 1966). Desta forma, o membro de vertebrados é um dos melhores modelos para estudar o mecanismo apoptótico. Durante o desenvolvimento dos vertebrados, os primórdios das extremidades apresentam áreas específicas de morte celular programada. As zonas necróticas anterior e posterior (ANZ e PNZ) são responsáveis por definir a forma mais proximal da extremidade do membro - o estilopódio e o zeugopódio. Já o opaque-patch, na parte central do mesênquima, vai definir os elementos esqueléticos do zeugopódio, o rádio e a ulna. Por último, as áreas necróticas interdigitais (INZs) vão esculpir a forma final dos dedos (Zuzarte and Hurlé, 2005). O controlo e localização específica destas áreas de morte celular programada é feito através de uma delicada interacção entre diferentes genes durante o desenvolvimento do membro. Das moléculas sinalizadoras que controlam a indução da apoptose, destacam-se as da família dos BMPs e FGFs (Ganan et al., 1996, Montero et al., 2001). De facto, para que a indução da morte celular programada seja eficaz, estas duas vias de sinalização devem actuar em conjunto (Montero et al., 2001). A actividade conjunta de BMPs e FGFs resulta na activação da expressão de genes específicos que são responsáveis, inicialmente, pela perda de comunicação celular no mesênquima, o que constitui um processo crucial para que a apoptose tenha lugar (Hurle and Fernandez-Teran, 1983; Martin-Bermudo et al., 1998). No final, a cascata das caspases é activada, o que culmina com a destruição controlada da célula (Zuzarte-Luis et al., 2004). A morte celular programada partilha muitos mecanismos com outros processos celulares como a proliferação e diferenciação. No entanto, a resposta à mesma proteína pode resultar em diferentes efeitos, dependo do contexto celular. No mesênquima da extremidade do membro observa-se que os BMPs podem induzir tanto diferenciação condrogénica como morte celular. De forma semelhante, os FGFs são, inicialmente, responsáveis pela sobrevivência da célula enquanto que, mais tarde, induzem a sua apoptose (Ganan et al., 1996; Montero et al., 2001). Para além das numerosas cascatas genéticas que se sabem estar envolvidas na indução e desenvolvimento do membro de vertebrados existem também mecanismos epigenéticos que influenciam a padronização do mesmo. Desta forma, fecha-se o ciclo entre informação genética e o ambiente celular. Entre estes mecanismos epigenéticos destacam-se os fluxos iónicos (Altizer et al., 2001). Estes têm sido implicados em diferentes processos tais como a migração, morte e diferenciação celulares (Morokuma et al., 2008). Foram também observados durante o desenvolvimento embrionário, onde são responsáveis, por exemplo, pela correcta formação das extremidades (Altizer et al., 2001). A acção de moléculas sinalizadoras na indução da apoptose tem sido principalmente estudada nas INZs. Resumidamente, a actividade do Ácido Retinóico activa a expressão de BMPs no espaço interdigital o que, em conjunto com a expressão de FGFs já existente nessa zona, induz a apoptose no interdígito (Rodriguez-Leon et al., 1999; Montero et al., 2001). No entanto, esta indução de morte celular programada deve ser precedida pela inibição da expressão de FGF8 na ectoderme distal do interdígito (Hernandez-Martinez et al., 2009). No final, a confluência de vários mecanismos nessas zonas resulta numa morte celular em massa nas áreas do interdígito. Este trabalho procura mostrar a existência de um elo de ligação entre a actividade de ERG, um canal de saída de potássio, e a morte celular programada durante o desenvolvimento dos membros. ERG pertence à família ether-a-go-go de canais de potássio dependentes de voltagem, e é detectado nas áreas apoptóticas do autopódio de galinha (Gallus gallus) e pato (Anas platyrhynchos). O facto de estar presente em todo o espaço interdigital de espécies com dedos livres (galinha) e só na parte mais distal do interdígito em pato onde a morte fisiológica ocorre, sugere que a sua função pode estar conservada evolutivamente. O padrão de expressão deste canal de potássio é detectado nas INZs, de forma espacial e temporalmente conservada nos dois organismos. Para analisar a função de ERG, realizaram-se estudos de perda de função através da electroporação in ovo de uma construção de RNAi específico para o gene em estudo. Outra abordagem usada para o mesmo fim foi a implantação de microesferas embebidas num inibidor químico do canal, de forma a possível bloquear funcionalmente a dinâmica de potássio intracelular no membro em desenvolvimento. A perda de função de ERG conduz a uma diminuição da morte celular programada nas áreas interdigitais, o que resulta em fenótipos de sindactilia (os dedos permanecem visivelmente unidos por uma membrana). A geração deste fenótipo é precedida pela inibição da expressão de genes envolvidos no processo apoptótico, tais como snail, msx2, bambi e fgf10, o que mostra que a actividade de ERG está directamente ligada à transdução de sinal nas vias de BMPs e FGFs. Assim, a acção de ERG é imprescindível no desencadear do processo apoptótico desde estádios muito iniciais da indução da morte celular. A relação de erg com as diferentes vias de sinalização génica envolvidas no desencadeamento do processo apoptótico - tais como a de FGFs, BMPs e Ácido Retinoico (RA) - foi também clarificada. Experiências de ganho de função utilizando microesferas embebidas nestas moléculas mostram que estas três vias de sinalização regulam a expressão de erg. Em particular, a sinalização por BMPs activa a expressão do mesmo. Pelo contrário, o bloqueio destas moléculas não resulta na inibição de erg. Estes dados sugerem que adicionalmente à sinalização via BMPs, existirá uma outra cascata genética a induzir e/ou manter a expressão de erg. Mas, mais importante, este estudo mostra que erg é um intermediário fundamental no estabelecimento das áreas de morte interdigital durante o desenvolvimento dos dedos, precedendo o começo da apoptose. Em conjunto, os resultados deste trabalho apoiam um modelo no qual ERG é responsável pelo destacamento celular e consequente indução de morte celular programada nas áreas interdigitais. Para além do controlo do destacamento celular através da activação do gene snail, uma outra função essencial do ERG na apoptose poderá ser a inactivação da expressão de fgf8 na ectoderme distal do interdígito, dado que a inibição da actividade do ERG leva à manutenção da expressão do fgf8 distalmente. No entanto, é necessária a realização de mais experiências para clarificar, nomeadamente, a indução da expressão de erg através de BMPs e Ácido Retinóico. Uma possível abordagem seria a inibição conjunta de um ou vários elementos destas vias de sinalização de forma a esclarecer quais os elementos que actuam de forma conjunta para a indução e/ou manutenção da expressão de erg. Seria também importante melhorar a electroporação interdigital de RNAi para conseguir a perda de função na maior parte do mesênquima interdigital, tal como a realização de western blots de maneira a comprovar que a proteína não é traduzida. Ao mesmo tempo, seria de grande interesse a clonagem da sequência completa de erg para estudos de sobreexpressão no autopódio, confirmando-se assim se o aumento da sua actividade poderia induzir morte celular ectópica