Production of a genomic CFTR construct inserted into a human artificial chromosome (HAC) and characterization of its expression

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010.Cystic Fibrosis is an autosomal recessive disorder, which makes it a good candidate for gene therapy. Thus cystic fibrosis became one of the first targets for gene therapy since apparently it is sufficient to deliver a normal copy of the gene encoding the CFTR protein to the affected cells. Although promising at first, classical gene therapy to cystic fibrosis has not met expectations due to immune response against viral vectors and synthetic vectors, as well as short-term expression of cDNA based transgenes. These hurdles can be overcome by delivering the complete genomic CFTR gene on non-integrating human artificial chromosomes (HACs). Here, we describe the reconstruction of the genomic CFTR locus into one P1-based artificial chromosome (PAC), CF225. This is a nonselectable PAC of 225.3 kb (running from -60.7 kb to +9.8 kb) which resulted from the ligation of two PACs, CF1-Met and CF6, with an optimized M470V codon and a silent XmaI restriction variant to discriminate transgene from endogenous expression. CF225 was shown to be stably maintained and propagated in the E. coli DH10B host. After co-transfection of CF225 with the telomerized, blasticidin-S selectable, centromere-proficient alpha satellite (cen 5) TTE1 construct into HT1080 fibrosarcoma lung cells, CF225 was not incorporated into a de novo HAC in 122 lines analyzed, but five integrants formed, four of which expressed the transgene, as detected by RT-PCR and XmaI restriction analyses. Stability analyses suggest feasibility to pre-fabricate a large, tagged CFTR transgene that stably replicates in the proximity of a functional centromere. Although definite conclusions about HAC proficient construct configurations cannot be drawn at this stage, an important transfer resource was generated and characterized, demonstrating promise of de novo HACs as potentially ideal gene-therapy vector systems.A terapia génica pode ser definida como a introdução de um gene exógeno numa célula receptora para a obtenção de benefícios terapêuticos. Os objectivos a longo prazo dos estudos relacionados com a terapia génica são o desenvolvimento de vectores como ferramentas para o estudo do genoma e da função cromossómica e para transferir genes para as células com fins terapêuticos. A Fibrose Quística é uma doença autossómica recessiva, o que implica que uma única cópia normal do gene CFTR, que codifica a proteína do mesmo nome, é suficiente para restaurar a função CFTR de canal de cloreto ausente em caso de mutação em ambos os alelos CFTR. Estas características tornam a Fibrose Quística um candidato atraente para a terapia génica, visto bastar transferir uma cópia do gene normal para as células afectadas para se obter a cura da doença. Assim, pouco tempo após a descoberta do gene CFTR, em 1989, tiveram início os primeiros esforços no sentido de tornar a terapia génica da Fibrose Quística uma realidade. Contudo, a terapia génica da Fibrose Quística tem como requisitos que o gene terapêutico deva ser expresso em todas as células epiteliais onde normalmente ocorre expressão, de preferência a níveis comparáveis aos do gene endógeno. Além disso, a expressão deverá ser estável e persistente, a fim de ser evitada a readministração repetida do gene terapêutico. A maioria dos vectores utilizados actualmente em terapia génica consiste em cassetes de expressão controlada por promotores heterólogos fortes, frequentemente derivados de vírus. Contudo, descobriu-se que muitos destes transgenes são expressos apenas durante um período de tempo limitado. A capacidade dos vírus para infectar as vias respiratórias fez deles a escolha natural inicial para a terapia génica da Fibrose Quística e muitos dos primeiros estudos foram efectuados com vectores virais derivados de adenovírus. A expressão do gene CFTR é regulada espaciotemporalmente, pelo que a sua estabilidade a longo prazo e expressão regulada de forma tecido-específica requerem não só o promotor e as porções codificantes do gene como também elementos cromossómicos reguladores, tais como os estimuladores e silenciadores, associados aos locais hipersensíveis à DNase I (DHS, na terminologia inglesa). Estes requisitos exigem a utilização de vectores de grande capacidade, como é o caso de vectores cromossómicos, tais como os cromossomas artificiais bacterianos (BACs), os cromossomas artificiais baseados no fago P1 (PACs) e os cromossomas artificias humanos (HACs). Há duas vantagens essenciais dos sistemas baseados em vectores cromossómicos em relação à maior parte dos vectores convencionais usados para transferência génica. Em primeiro lugar, o DNA transferido pode ser mantido estavelmente sem os riscos associados à inserção e, em segundo lugar, podem ser introduzidos grandes segmentos de DNA englobando os genes e os seus elementos reguladores, conduzindo à expressão do transgene mais fiável e fisiológica, mais próxima da do gene normal. Além disso, os vectores cromossómicos constituídos apenas por DNA humano não deverão ser imunogénicos. Tratando-se da Fibrose Quística, o epitélio das vias respiratórias é o alvo mais importante, uma vez que a doença pulmonar é a que contribui principalmente para a morbilidade e a mortalidade. Dado que esta doença, pelo menos nas etapas iniciais, afecta essencialmente as vias respiratórias inferiores, é provável que as células epiteliais destas vias sejam importantes, sendo consideradas por muitos autores como as células alvo apropriadas para a terapia génica da Fibrose Quística. Após a produção do constructo genómico CGT21 que contém aproximadamente metade do locus do gene CFTR e o último exão e da demonstração de que ele era propagado estavelmente em células de sarcoma do pulmão, onde era expresso e sofria splicing correcto (Laner et al., 2005), o passo lógico seguinte era gerar um constructo CFTR genómico portador dos 27 exões e das sequências reguladoras flanqueantes para incorporação num HAC. O objectivo consistia na reconstituição do gene CFTR completo clonado num PAC [o PAC usado neste trabalho foi o pCYPAC2 (Ioannou et al., 1994)] adequado para a preparação em grande escala de DNA de elevada qualidade. Nós descrevemos aqui a construção de um locus CFTR contendo os 27 exões e a maior parte das potenciais regiões reguladoras num só CF PAC. Partindo de preparações de DNA armazenadas em plugs de agarose e previamente caracterizadas (Ramalho et al., 2004), contendo parte do gene CFTR em PACs, nós construímos o PAC CF225, portador do gene CFTR humano com todos os exões e intrões mais sequências reguladoras, ligando dois PACs, CF1-Met e CF6, contendo cada um aproximadamente metade do gene CFTR e regiões flanqueantes: o PAC CF1-Met é portador de um inserto que vai de -60,7 kb a montante do início da tradução no exão 1 até ao intrão 10, e o PAC CF6 é portador de um inserto que vai do intrão 10 até +9,8 kb a jusante (relativamente ao fim da tradução). Devido à escolha dos PACs originais, os intrões 9 e 10 estão substancialmente encurtados em 5,1 kb e 27,1 kb, respectivamente. Como consequência, os locais hipersensíveis à DNase I (DHS) descritos no intrão 10 (McCarthy and Harris, 2005) estão excluídos do locus CF225. Contudo, este clone tem a vantagem de conter o codão da metionina (M) optimizado no locus polimórfico M470V, em comparação com os clones wild type, e uma variante de um local de restrição XmaI silencioso sintético, o qual é adequado para discriminar entre os produtos de RT-PCR do transgene e os provenientes dos loci CFTR endógenos de qualquer célula alvo. A fim de concretizar um dos objectivos do presente trabalho, partimos de três clones PAC, CF1-Met10-43/-44/-54, cujo exão 10 tinha sido modificado para conter metionina (M) em lugar da valina (V) na posição 470, bem como um local de restrição para a enzima XmaI, introduzido por uma mutação silenciosa. O conteúdo destes clones foi sujeito a diferentes análises antes da construção de CF225: 1) amplificações por PCR cujos produtos abarcavam toda a região do exão 10 clonada bem como sequências wild-type localizadas a montante e a jusante, as quais mostraram que os tamanhos dos produtos de PCR estavam de acordo com o esperado nos três clones; 2) sequenciação do exão 10 clonado, que confirmou a orientação correcta, a presença do polimorfismo corrigido V470M e que a sequência nos três clones não possuía qualquer mutação derivada de PCR; 3) análise de restrição, tendo revelado que as bandas esperadas correspondiam aos locais de restrição sintéticos XmaI e NotI; 4) digestão de 1/10 de uma plug de agarose dos três clones CF1-Met com as enzimas de restrição NotI e/ou BssHII também mostrou os tamanhos esperados para os fragmentos obtidos; 5) os tamanhos esperados para as bandas foram demonstrados para os três clones por reacções de PCR de longo alcance (LR-PCR, segundo a terminologia inglesa) de baixo número de ciclos, cobrindo toda a sequência CFTR clonada nos PACs CF1-Met, incluindo a redução de 5,1 kb no intrão 9. Estes dados indicam que os clones continham o inserto completo sem rearranjos. Como a banda de 31,8 kb do subclone CF1-Met10-43 era muito fraca em comparação com os produtos dos outros subclones bacterianos, indicando possivelmente uma alteração em algumas das bactérias usadas na preparação das plugs, o clone correspondente não foi mais usado. Depois de confirmar que a sequência CFTR clonada no PAC CF1-Met tinha a mesma estrutura que a clonada no PAC CF1 original, o passo seguinte era fundir o PAC CF1-Met com o inserto do PAC CF6, o qual é portador do resto da sequência genómica de CFTR com as sequências dos exões e das junções exão/intrão correctas. A estratégia de clonagem foi a seguinte: 1) digestão parcial do PAC CF1- Met (clone 44) com NotI, digestão total de CF6 com NotI seguido por desfosforilação para impedir a recircularização do vector; 2) separação dos produtos de digestão por electroforese em gel de campo pulsado (PFGE, de acordo com a terminologia inglesa) e excisão das bandas do gel sem exposição a UV; 3) electroeluição dos fragmentos de DNA existentes nos pedaços do gel e sua mistura numa razão de ~1/1 (CF1-Met/CF6); ligação do DNA pela ligase T4; 5) electroporação do produto de ligação em E. coli DH10B; 6) selecção, por PCR, das colónias resistentes à kanamicina com os primers CFi10fus/R7, específicos da região de fusão entre os dois PACs. Foi identificado um clone, mais tarde designado por CF225, positivo para a reacção de PCR relativa à região de fusão e para STSs dos exões 4 e 12, presentes nos dois PACs que foram ligados. Após a identificação do clone positivo, o passo seguinte deveria ser a análise da sua estabilidade enquanto clone. Assim, durante o crescimento inicial da cultura mãe das bactérias portadoras do PAC CF225, foram plaqueados doze subclones individuais e analisados por PCR para avaliação da estabilidade da clonagem. Nove dos doze subclones continham os oito STSs testados por PCR e que cobriam o locus em diferentes posições ao longo do gene CFTR, incluindo sequências localizadas a montante do início da transcrição, a região da fusão entre os dois PACs e a região poli (A). Para analisar mais detalhadamente a estabilidade de clonagem, três culturas derivadas de clones individuais do PAC CF225 foram crescidas durante vários períodos de tempo, simulando um rendimento final potencial de 1015, 1021 e 1027 células de E. coli, contendo cada uma até ~10 cópias totalmente replicadas do constructo. A digestão do material contido em plugs de agarose, proveniente das colónias derivadas dos três subclones individuais, mostrou a presença, em todos os casos, de um inserto com o tamanho de 225 kb (SalI) e fragmentos idênticos e com os tamanhos previstos (BssHII), indicando uma estabilidade de clonagem global elevada para o locus. Os dados indicavam também a propagação fiel e estável do locus CFTR no PAC CF225 (inserto de 225,3 kb), demonstrando que o gene CFTR pode ser clonado de forma estável em E. coli. Ainda continuando a análise estrutural do constructo, seguiu-se a sequenciação das suas extremidades, em que o inserto CFTR se liga ao vector. Assim, para determinar os extremos de CF225, foram efectuadas reacções de LRPCR com primers que se ligam nas extremidades 5’ e 3’ da junção inserto/vector. Os fragmentos amplificados foram sequenciados e comparados por meio do programa BLAST com o hg built 37.1 no site NCBI. O locus CFTR reconstruído vai do nucleótido -60651 relativamente ao início da tradução ao nucleótido +9767 relativamente ao final da tradução. Ambas as extremidades coincidem com um local de restrição para Sau3AI, o que está de acordo com o facto de, para a preparação da biblioteca RPCIP704, para a qual foi utilizado o PAC pCYPAC2, que serviu de fonte para a construção de CF225, o DNA genómico ter sido parcialmente digerido e clonado no local BamHI do vector. Como resultado do procedimento da clonagem, CF225 tem duas deleções nos intrões 9 e 10 as quais representam regiões que não estavam incluídas nos PACs originais CF1 (intrão 9) e CF6 (intrão 10) e que foram omitidas pela reconstrução do exão 10 e das suas sequências intrónicas flanqueantes. Para localizar com precisão e determinar a extensão daquelas deleções, foram realizadas reacções de PCR com primers que hibridam em regiões que flanqueiam as duas deleções. Os produtos de PCR foram sequenciados e comparados por meio do programa BLAST com BACs portadores de sequências genómicas humanas publicadas. Ambas as deleções foram localizadas com precisão, tendo a deleção no intrão 9 5058 pb, ao passo que a deleção no intrão 10 tem 27128 pb. Para conseguir a incorporação do locus CFTR num cromossoma humano artificial (HAC, na terminologia inglesa) formado de novo, foram efectuadas experiências de co-transfecção do locus CFTR clonado com um constructo linearizado portador de sequência de DNA alfa-satélite do centrómero e a expressão dos clones celulares obtidos analisada. Quatro ensaios independentes de colipofecção do inserto de 225 kb do PAC CF225 com o constructo TTE1 (fragmento de 133 kb) contendo um gene marcador de resistência à blasticidina S (BS) duplicado e o marcador EGFP, bem como sequências centroméricas, resultaram em 185 clones celulares, 122 dos quais foram expandidos e analisados por PCR com primers específicos para CF225. Cinco clones celulares individuais, BW24, BG32, CG13, DG27 e DG5 eram positivos para a reacção de PCR específica, indicando que apenas 1 em ~25 clones foram co-transfectados em simultâneo com CF225 e TTE1. Foram realizadas reacções de RT-PCR com primers que geram um produto entre os exões 8 e 10 que, após splicing, tem 391 pb e representa uma mistura de produtos dos genes CFTR endógenos da linha celular HT1080 e do locus transgénico. Como resultado destas experiências, verificou-se que quatro (BG32, CG13, DG27 e DG5) das cinco linhas co-transfectadas expressavam o locus transgénico. Todas as linhas que expressavam evidenciavam níveis variáveis de expressão CFTR após 30 dias de crescimento sem selecção. Para distinguir entre a expressão endógena e a do transgene, os produtos de RT-PCR foram clivados com XmaI que digere o exão 10 modificado de CF225 em dois fragmentos de 310 pb e 81 pb. Nas quatro linhas celulares, proporções variáveis do transcripto CFTR resultavam do transgene, o que demonstrava, em muitos casos, níveis de expressão do transgene acima dos dos genes endógenos (cujos produtos de RT-PCR não eram clivados por XmaI) e mostravam a ocorrência de splicing correcto. As linhas celulares que expressavam e as células HT1080 parentais foram analisadas por sequenciação dos produtos de RT-PCR obtidos com os mesmos primers e também com o primer CFc3F (exão 3), demonstrando que todas as linhas continham tanto o polimorfismo 470M como a variante sintética XmaI no exão 10, confirmando que tinham origem no transgene. Para verificar a integridade do constructo CF225 nas linhas celulares clonais, foram realizadas reacções de PCR com primers para a junção vector/CFTR a 5’ e para a junção vector/CFTR a 3’. Das cinco linhas celulares derivadas de HT1080 apenas DG27 manteve a extremidade 5’ de CF225, confirmada pela sequenciação do produto de PCR. Todas as 5 linhas foram negativas para a reacção de PCR relativa à extremidade 3’, bem como para duas outras reacções de LR-PCR que abrangiam aproximadamente 2 kb e 3 kb desde a extremidade 3’ do vector até ao locus CFTR, sugerindo que o DNA de CF225 a 3’ foi perdido em todas as quatro linhas que expressavam. A fim de averiguar se se tinha formado um cromossoma de novo ou se havia ocorrido integração no genoma da célula, foram efectuados ensaios de FISH de tripla cor nestas linhas celulares após 30 dias de crescimento com e sem selecção por BS. Estas análises revelaram ou integração do locus CF225 num cromossoma do hospedeiro ou integração e truncação em todas as cinco linhas celulares clonais. Não se observaram HACs portadores do locus CFTR. A linha clonal DG27 mostrou co-integração estável próximo do gene CFTR endógeno no cromossoma 7. A linha BG32 revelou uma integração distal/telomérica num cromossoma que não o 7. A linha celular DG5 mostrou a integração de sinais de CF1, CF6 e E1 (centrómero) numa posição distal do cr19q e a linha CG13 mostrou integração de porções de CF1 e CF6 no braço p de um cromossoma metacêntrico que não o 7, acompanhada por truncação. Na linha celular BW24 apenas foram detectadas sequências de CF6 num pequeno cromossoma truncado. No geral, podemos concluir que CF225 e o centrómero E1 não formaram eficientemente em conjunto uma estrutura de replicação estável. Em vez disso, foram seleccionados raros clones estáveis que continham pelo menos o marcador BS e várias porções do locus CF225 sem a extremidade 3’, que todavia mostraram expressão e splicing correcto da sequência do exão 10 em 4 das 5 linhas obtidas. No presente trabalho foram também feitas tentativas de construção de um HAC de novo (pré-fabricado) por uma abordagem de recombinação in vitro por meio de digestão enzimática e ligação, seguida de electroporação em E. coli, de um constructo portador do locus CF225 e de TTE1, contendo sequências de DNA centromérico. Escolheu-se uma abordagem de recombinação in vitro para a construção porque esta técnica é mais reprodutível e menos propensa a rearranjos do que as abordagens de recombinação in vivo. Não foi possível obter o HAC préfabricado e é sugerida uma estratégia para uma futura obtenção do mesmo. A produção de um HAC de novo, com todas as vantagens que este tem sobre os vectores virais, é muito importante para o desenvolvimento de uma terapia génica de sucesso para o tratamento da Fibrose Quística. Este trabalho representa mais um passo em frente no sentido de tornar a terapia génica para a Fibrose Quística uma realidade e os resultados obtidos aqui deixam antever a possibilidade de criação de um cromossoma artificial humano portador do gene CFTR e respectivas sequências reguladoras o qual representaria um vector ideal e uma promessa de cura para a Fibrose Quística, independentemente da mutação causadora de doença.Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT), (SFRH/BD/17912/2004); Centro de Investigação BioFIG (Center for Biodiversity, Functional & Integrative Genomic