Identificação e genotipagem de Treponema pallidum subsp. pallidum em amostras clínicas

Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO agente etiológico da sífilis, Treponema pallidum subsp. pallidum, é uma bactéria helicoidal de forma espiralada, com movimento característico em forma de 'saca-rolhas' e tem como único hospedeiro natural o Homem causando uma infecção sexualmente transmitida. O seu diagnóstico baseia-se, essencialmente, na associação dos sinais e sintomas clínicos com testes serológicos, uma vez que não é possível cultivar este microrganismo. O diagnóstico com base em técnicas de PCR tem sido descrito mas com sensibilidade e especificidade, nas fases assintomáticas da doença, pouco elevadas. Assim, os objectivos deste estudo foram comparar o diagnóstico obtido por quatro testes serológicos e optimizar e aplicar a várias amostras clínicas, colhidas de indivíduos com suspeita de terem sífilis, uma técnica de PCR diagnóstica (gene da lipoproteína de 47 kDa) e de subtipagem (gene tpr) de Treponema pallidum. Comparando as técnicas serológicas, verificou-se que a taxa de concordância entre os testes não treponémicos foi de 98,5% e de 97,1% para os testes treponémicos. Constatou-se que a sensibilidade das técnicas de RPR, de VDRL e de TPHA foi de 71,4, 74,5 e 98%, respectivamente. A especificidade foi de 97,2% para o teste RPR e para o VDRL e de 96,3% para o TPHA. A PCR diagnóstica evidenciou uma fraca sensibilidade pois, das 90 amostras testadas, apenas foram identificados seis casos de infecção por Treponema pallidum. A análise por PCR-RFLP revelou um perfil para uma das amostras mas, não correspondendo a qualquer subtipo descrito, deverá ser confirmada por sequenciação. Os resultados obtidos, e estudos efectuados por outros investigadores, parecem demonstrar a necessidade de desenvolver testes mais eficazes para o diagnóstico das fases assintomáticas da sífilis, de modo a ser possível um diagnóstico mais correcto e eficaz que contribuirá para um melhor controlo da doença.The etiological agent of syphilis, Treponema pallidum subsp. pallidum, is a helicoidal bacterium, with a characteristic corkscrew movement. Humans are the only natural host, in whom it causes a sexually transmitted infection. The diagnosis is essentially based on the association of clinical signs and symptoms with the serological tests, since it is impossible to cultivate this microorganism. Several PCR techniques have been described but their sensitivity and specificity during asymptomatic phases are still very low. Thus, the objectives of this study were to compare the diagnostics obtained by four serological tests and perform the optimization of a PCR diagnostic technique (47 kDa lipoprotein gene), as also of a T. pallidum subtyping PCR technique (tpr gene), in order to apply them to several clinical samples, collected from individuals suspected of having syphilis. After comparing the serological techniques, we verified a concordance rate of 98.5% for the nontreponemal tests and 97.1% for the treponemal tests. The sensitivity of the RPR, VDRL and TPHA techniques was 71.4%, 74.5% and 98%, respectively. Specificity was 97.2% for the RPR and VDRL techniques, while for the TPHA was 96.3%. The diagnostic PCR technique showed a low sensibility since, from the 90 test samples, only six cases of infection by Treponema pallidum were identified. The PCR-RFLP analysis revealed a profile for one of the samples but, since it does not match any of the described subtypes, it should be confirmed by sequencing. The results obtained, along with studies made by other investigators, appear to show the need for developing more effective tests for the diagnosis of asymptomatic phases of syphilis, in view of a better and more efficient diagnosis that will contribute for a better disease control