Diversidade genómica, patogenicidade e sensibilidade a compostos bioactivos em Xanthomonas campestris

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO género Xanthomonas pertence à subdivisão gama de Proteobacteria, incluindo 27 espécies fitopatogénicas que infectam 124 espécies de plantas monocotiledóneas e 268 de dicotiledóneas. 121 isolados de Xanthomonas spp. foram sujeitos a uma caracterização genotípica, utilizando BOX-, ERIC- e MSP-PCR. Esta estratégia permitiu a tipificação dos isolados de X. fragariae e X. campestris, revelando também a elevada variabilidade genotípica de algumas das espécies deste género, especialmente de X. axonopodis e espécies relacionadas. A caracterização fenética e filogenética de isolados portugueses de Xanthomonas spp. obtidos de crucíferas foi realizada utilizando a determinação do perfil metabólico, de testes de patogenicidade e ensaios biológicos em plantas diferenciadoras para determinação das raças de X. campestris pv. campestris (Xcc), PCR com 'primers' específicos, caracterização genotípica por rep-PCR, sequenciação do genes de rRNA 16S e de gyrB e análise dos espectros MALDI-ToF (Matrix Assisted Laser Dessorption Ionisation Time of Flight). Esta abordagem polifásica permitiu verificar a nível infra-específico a elevada diversidade genotípica e filogenética destes isolados, que contrasta com a homogeneidade das suas características culturais e metabólicas. Verificou-se também uma grande diversidade de perfis de patogenicidade, sendo apenas 32,4% dos isolados incluídos nas raças de Xcc, pelo que, na generalidade, a classificação em raças não se revelou adequada para a tipificação de perfis de virulência. A aplicação de MALDI-ToF originou uma árvore taxonómica de topologia semelhante à obtida com base na análise de gyrB, excepto para o isolado CPBF 1257. O isolado CPBF 47 revelou características atípicas para a generalidade das abordagens utilizadas, sendo exemplar único de uma espécie distinta das até agora descritas. Finalmente, determinou-se a sensibilidade de isolados de Xcc a compostos bioactivos presentes nos óleos essenciais de plantas aromáticas. Foi possível observar uma elevada actividade antibacteriana do óleo essencial de orégãos e cravinho, indicando o seu potencial como alternativa biotecnológica para o controlo de X. campestris e de espécies relacionadas.The genus Xanthomonas belongs to the gamma subdivision of Proteobacteria, including 27 pathogenic species, infecting at least 124 monocotyledonous and 268 dicotyledonous plant species. 121 strains of Xanthomonas spp. from the Portuguese Collection of Phytopathogenic Bacteria (CPBF) were studied at the genotypic level, using BOX-, ERIC- and MSP-PCR. This approach allowed to typify and to characterize strains of X. fragariae and X. campestris, also revealing the high genotypic variability of some species within this genus, especially X. axonopodis and related species. Portuguese isolates of Xanthomonas spp. obtained from crucifers were phenetically and phylogenetically characterized through metabolic profiling, pathogenicity tests, biological assays on differential hosts to determine X. campestris pv. campestris (Xcc) races, PCR with specific primers, genotypic characterization by rep-PCR, phylogenetic analysis of 16S rRNA and gyrB genes and MALDI-ToF (Matrix Assisted Laser Dessorption Ionisation - Time of Flight) spectral analysis. This polyphasic approach showed a high genotypic and phylogenetic diversity at the infra-specific level, which contrasts with the homogeneity of their cultural and metabolic features. There was also a great diversity of pathogenicity profiles, with only 32.4% of the isolates being included in previously determined Xcc races. Therefore, for the majority of the isolates, the classification into races was not adequate for the characterization of their pathogenic profiles. The application of MALDI-ToF produced a tree with similar topology to that obtained using gyrB phylogenetic data, except for the isolate CPBF 1257. Isolate CPBF 47 showed atypical features for most of the approaches used and therefore seems to be an unique specimen of a species distinct from hitherto described. Additionally, the sensitivity of isolates of Xanthomonas spp. to bioactive compounds present in the essential oils of aromatic plants was determined. A strong antibacterial activity was shown by the essential oil of oregano and clove, indicating their potential for a future biotechnological approach towards the control of Xc and related species