Caracterização fenotípica e molecular de isolados de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli de origem avícola

Tese de doutoramento em Biologia (Microbiologia), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008Numa perspectiva de abordagem polifásica, 187 isolados de Campylobacter spp. de origem avícola de Angola e Portugal foram submetidos a uma análise de identificação e tipificação, utilizando métodos fenotípicos e moleculares. Com a biotipagem identificaram-se 111 isolados de C. jejuni (12 de Angola e 99 de Portugal) e 76 de C. coli (55 de Angola e 21 de Portugal). A resistência a 7 antibióticos (eritromicina, claritromicina, ampicilina, estreptomicina, oxitetraciclina, ácido nalidíxico e ciprofloxacina) foi avaliada determinando as CMI's das quais resultaram 40 resistotipos entre os 143 isolados analisados, dois deles multi-resistentes. Na abordagem molecular, foi desenvolvido um método de identificação por gyrA-PCR que confirmou 101 isolados de C. jejuni e 76 de C. coli biotipicamente identificados. Os restantes 10 isolados de C. jejuni foram reclassificados como C. coli, tendo em conta os resultados obtidos com gyrA-PCR. Utilizando as endonucleases Sau3AI e HaeIII na digestão simples dos ITS e EcoRI e PstI na digestão dupla do gene flaA, as análises por ITS-ARDRA e RFLP-flaA mostraram-se incapazes de identificar estes isolados a nível de espécie. Além disso, o número reduzido de perfis-tipos obtidos revelou um baixo poder de discriminação para estas técnicas. Na tipificação dos isolados, recorreu-se ainda a análises dos polimorfismos de amplificação obtidos com os primers 1281 e 1290 (RAPD), REPI e REPII (Rep-PCR) e csM13 (M13- PCR), estimando-se valores elevados de diversidade entre os isolados de cada espécie com RAPD e Rep-PCR, enquanto que M13-PCR foi o menos diferenciante. A avaliação da reprodutibilidade, a capacidade de tipificação e o poder discriminante das técnicas de PCR-fingerprinting evidenciaram a sua maior aplicabilidade na genotipagem de Campylobacter spp.. O uso de uma abordagem polifásica, congregando todas as técnicas de PCR-fingerprinting , revelou-se como mais eficiente na tipificação e avaliação da diversidade genómica, tendo em conta a fraca estrutura clonal das populações de Campylobacter spp. analisadas.In a polyphasic approach, 187 Campylobacter spp. isolates of poultry origin from Angola and Portugal were identified and typed by phenotypic and genotypic methods. With the biotyping method, 111 C. jejuni (12 from Angola and 99 from Portugal) and 76 C. coli (55 from Angola and 21 from Portugal) isolates were identified. The resistance to 7 antibiotics (erythromycin, clarythromycin, ampicillin, streptomycin, tetracycline, nalidixic acid and ciprofloxacin) was evaluated by assessment of CMIs and 40 antibiotypes were found among 143 isolates, two of them multiresistant. In the molecular approach, a gyrA-PCR identification assay was developed and 101 C. jejuni and 76 C. coli isolates, previously identified by biotyping, were confirmed. The remaining 10 isolates were misidentified as C. jejuni and their classification was revised as C. coli, based on gyrA-PCR. Using Sau3AI and HaeIII endonucleases in the single restriction analysis of ITS and EcoRI and PstI in the double digestion of flaA gene fragments, ITS-ARDRA and RFLP-flaA analyses were unable to identify these isolates at species level. Furthermore, a reduced number of restriction profiles was obtained, revealing a low discriminatory power for these methods. In the typing of the isolates, analyses of the amplification polymorphisms obtained with "primers" 1281 and 1290 (RAPD), REPI and REPII (Rep-PCR) and csM13 (M13-PCR), revealed high diversity values within each species both with RAPD and Rep-PCR, while M13-PCR showed to be the least discriminatory. The evaluation of the reproducibility, the typeability and the discriminatory power of PCRfingerprinting techniques highlighted their higher applicability for Campylobacter spp. genotyping. The use of a polyphasic approach, integrating all PCR-fingerprinting techniques, revealed to be more efficient on typing and assessment of genomic diversity, taking into account the weak clonal structure of the analysed Campylobacter spp. populations