Utilização de lisinas de bacteriófagos no controlo de bactérias patogénicas gram-positivas

Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs endolisinas ou, simplesmente, lisinas são hidrolases da parede celular bacteriana, sintetizadas na fase final do ciclo lítico de fagos de DNA de cadeia dupla, cuja acção permite a libertação da progenia viral. Diversos estudos recentes demonstraram que as lisinas quando aplicadas exogenamente a bactérias Gram-positivas, como proteínas recombinantes purificadas, têm a capacidade de degradar o peptidoglicano da parede celular, causando a lise rápida da célula bacteriana. Com este trabalho pretendeu-se inicialmente caracterizar, clonar e expressar lisinas activas contra Staphylococcus aureus e Propionibacterium acnes. Para aumentar a solubilidade destas enzimas produziram-se proteínas truncadas, contendo apenas o domínio catalítico e, lisinas quiméricas em que se conjugaram diferentes domínios catalíticos e motivos de ligação à parede celular de origem heteróloga. As lisinas que demonstraram melhor solubilidade e actividade lítica foram purificadas por cromatografia de afinidade. Estas foram uma lisina truncada (Lys161) contendo apenas o domínio de endopeptidase CHAP da lisina Lys87, especifica para S. aureus, e duas lisinas quiméricas (Lys168- 87 e Lys170-87) contendo, respectivamente, os domínios catalíticos endopeptidase CHAP e de Amidase-2 de lisinas de Enterococcus sp., fundidos ao domínio C-terminal de Lys87 que apresenta os motivos de ligação ao peptidoglicano. A avaliação da actividade lítica das lisinas em isolados bacterianos de meios hospitalares e da comunidade evidenciou um elevado potencial lítico das lisinas quiméricas em mais de 90% das estirpes de S. aureus testadas, incluindo uma elevada fracção destas com resistência à meticilina. Estas quimeras demonstraram também capacidade de lise em estirpes de Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus e Bacillus spp. A lisina truncada Lys161, comparativamente, apresentou menor actividade lítica, com redução do espectro lítico. Os resultados obtidos demonstram o potencial das lisinas quiméricas produzidas na eliminação de bactérias patogénicas, incluindo estirpes de S. aureus resistentes à meticilina.Endolysins, or simply lysins, are bacterial cell wall hydrolysing enzymes that are produced at the end of the lytic cycle of double stranded DNA phages, to allow the release of viral progeny. Many recent studies have shown that when applied externally to Gram-positive bacteria, as purified recombinant proteins, lysins are capable of degrading the cell wall peptidoglycan, resulting in a rapid bacterial cell lyses. This study initially aimed the characterization, cloning and expression of lysins targeting Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes. To increase their solubility the enzymes were produced in the form of truncated proteins, which exclusively carried the catalytic domain, and chimerical polypeptides where different catalytic and cell wall binding domains of heterologous origin were fused. The lysins that exhibited higher solubility and lytic activity were purified by affinity chromatography. Specifically, these were a truncated derivative of Lys87 (Lys161), containing only a CHAP peptidase domain acting on S. aureus, and two chimerical lysins (Lys168-87 and Lys170-87) comprising, respectively, the functional CHAP peptidase and amidase-2 domains of Enterococcus sp. lysins fused to the cell wall targeting domain of the S. aureus lysin Lys87. The evaluation of lysin bacteriolytic activity on bacterial clinical isolates from hospital and community samples showed a high lytic potential of chimerical lysins, which were able to lyse more than 90% of the tested S. aureus strains, including a high fraction of methicillin-resistant isolates. These chimeras also displayed lytic activity against strains of Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus and Bacillus spp. Truncated lysin Lys161 showed less lytic activity and a narrow spectrum when compared to the chimerical endolysins. Our results demonstrate the potential of chimerical lysins to eliminate pathogenic bacteria, including methicillin-resistant S. aureus strains