The feedback regulation of miRNA biogenesis in responce to water deficit in Medicago truncatula

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasOs microARNs (miARNs) são pequenas moléculas de ARN com um tamanho de 20 a 24 nucleótidos (nt) e apresentam-se como reguladores negativos da expressão génica. As proteínas Dicer-like 1 (DCL1) e Argonaute 1 (AGO1) estão envolvidas na via de produção de miARNs e seus mARNs são regulados por miR162 e miR168 respectivamente. O principal objectivo deste trabalho foi analisar como se processa esta regulação em feed-back negativo na planta modelo Medicago truncatula sujeita a condições de défice hídrico. As plantas foram sujeitas a progressiva supressão da irrigação e de acordo com a avaliação do conteúdo hídrico relativo (CHR) das folhas, foram divididas em quatro grupos: controlo, défice hídrico moderado, défice hídrico severo e recuperação. Primeiro, foi analisada a expressão de 4 genes descritos por serem induzidos em resposta ao défice hídrico - Early Responsive to Dehydration 1 (ERD1), Plasma membrane intrinsic protein 1;5 (PIP1;5), Dehydrin e L-Myo-inositol-1-phosphate Synthase (MI-1-PS) - para comparar com os valores do CHR das plantas. Todos aumentaram a sua expressão na parte aérea e nas raízes em condições de défice hídrico, apresentando uma relação temporal e inversa com o CHR das plantas, à excepção do MI-1-PS na parte aérea. Em segundo, a expressão de miR162 reduziu e de DCL1 aumentou com o défice hídrico. Desta forma concluímos que DCL1 está a ser regulado nas raízes por miR162 em M. truncatula sujeita a condições de falta de água. Em ultimo, foram identificados em M. Truncatula, 3 genes codificantes para DCLs e 9 para AGOs envolvidos outras vias de processamento de pequenos ARNs. Observámos que têm os níveis de expressão aumentados em situação de défice hídrico. A MtAGO7 está envolvida na produção dos denominados trans-acting small RNAs e a MtDCL3, MtAGO4b e MtAGO4c, estão envolvidas em processos de metilação do DNA e consequente silenciamento transcripcional de genes.The microRNAs (miRNAs) are small RNAs with 20-24 nucleotides that negatively regulate the transcripts of several genes. Dicer-like 1 (DCL1) and Argonaute 1 (AGO1) are two key proteins involved in the miRNA biogenesis and their mRNAs are feedback regulated by miR162 and miR168 respectively. The main goal of this work was to study this mechanism of regulation of miRNAs biogenesis in Medicago truncatula under different water deficit conditions. Plants were subjected to progressive water deprivation and according to the evaluation of their water status by the leaf relative water content (RWC) were divided in four groups: control, moderate water deficit, severe water deficit and recovery. First, we analyzed the expression of 4 water deficit-responsive genes - Early Responsive to Dehydration 1 (ERD1), Plasma membrane intrinsic protein 1;5 (PIP1;5), L-Myo-inositol-1-phosphate Synthase (MI-1-PS) and Dehydrin - to establish a relation with the RWC of the plants. We found that the expression levels of ERD1, PIP1;5 and Dehydrin genes in plant shoots and roots and MI-1-PS in roots were temporally and inversely correlated with the plants RWC parameters, confirming that progressive water deficit induces an increase in transcription of water deficit-responsive genes. Second, we showed that miR162 was down-regulated in M. truncatula in water deficit whereas its target, DCL1, was up-regulated. This indicates that miR162 is regulating the mRNA levels of DCL1 in M. truncatula plants under water deficit. Third, in a bioinformatic screen we found and characterized the protein sequence of 3 and 9 new DCLs and AGOs in M. truncatula. The expression analysis of some of these genes under water deficit, showed up-regulation of genes encoding proteins involved in small RNA silencing pathways like direction of chromatin methylation for silencing of gene transcription (DCL3, AGO4b and AGO4c) or the production of trans-acting small interfering RNAs derived from TAS3 gene transcripts (AGO7)