Relação estrutura/função das proteínas da família APOBEC e sua interacção com a proteína Vif do HIV-1

Tese de mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética) apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2007Human cytidine deaminase APOBEC3G (A3G) restricts replication of Vif-deficient HIV- 1 by deaminating the minus chain of the viral cDNA. HIV-1 Vif prevents this host restriction factor from entering the virion by inducing their proteasomal degradation. Therefore the interaction between these cellular restriction factors and Vif is a good target for antiviral drug design. To study this interaction we used a TEM-1 ß-lactamase complementation assay (PCA), in which the inactive domains of the enzyme are fused to each of the proteins in question. The interaction of our proteins will result in a functional TEM-1 ß-lactamase capable of hydrolysing a substrate measurable by spectrophotometry. We mutated several residues of both A3G and Vif described as being involved in the Vif/A3G interaction, like the amino acid D128 of A3G and the D14RMR and Y40RHHY regions of Vif. Our work shows that, as previously described, the A3G 128 residue is essential for the interaction with Vif. We also determined that the A3G amino acids at positions 122 and 127, that were previously described as essential for interaction with Gag might also be important for Vif interaction. Both DRMR and YRHHY mutations to alanines in Vif did not show any detectable effect upon the Vif/A3G interaction. Some of the most unexpected results came from the high levels of detectable interaction of a DRMR to SEMQ mutated version of Vif with A3F, A3C and A2 but not with A3G. This particular mutation in Vif corresponds to the substitution of the DRMR that we find in HIV-1 Vif, to the sequence found in SIVAGM Vif. We can only speculate on the relevance of this region, but it is possible that the different affinities of these motifs are the result of an evolutive fine-tuning mechanism designed to, ultimately, improve HIV-1 infectionA desaminase de citidina humana APOBEC3G (A3G) é capaz de restringir a replicação de HIV-1 que não expressa Vif, através da desaminação da cadeia negativa de cDNA viral. A proteína Vif do HIV-1 induz a degradação proteossomal de A3G, impedindo que este factor de restrição seja encapsidado. Este processo faz com que a interacção da Vif com factores de restrição celulares da família APOBEC seja um bom alvo para o desenvolvimento de novas terapias antivirais. Escolhemos, para estudar esta interacção, um ensaio de complementação proteica (PCA) baseado na enzima TEM-1 ß-lactamase, no qual cada um dos domínios inactivos da enzima está fundido com cada umas das proteínas em estudo. A interacção das proteínas alvo resulta numa ß-lactamase funcional, capaz de provocar a hidrólise mensurável de um substrato por espectrofotometria. O nosso trabalho incidiu sobre aminoácidos e regiões de Vif e A3G descritos como importantes para a interacção destas duas proteínas, como são os casos do aa D128 do A3G ou as regiões D14RMR e Y40RHHY da Vif. Tal como descrito o nosso trabalho mostra que, o resíduo 128 de A3G é essencial para a interacção com Vif e que os aminoácidos 122 e 127, descritos como importantes apenas para interacção com Gag, podem também estar envolvidos na interacção com Vif. Ao contrário do esperado, não verificámos qualquer tipo de redução da interacção de Vif com A3G, em resultado das alterações nas regiões DRMR ou YRHHY da Vif. O resultado mais inesperado foi a obtenção de valores elevados da interacção da Vif DRMR>SEMQ com outros membros da família APOBEC, nomeadamente A3F, A3C e A2, mas não com A3G. Este resultado pode resultar do facto de a mutação na Vif corresponder à substituição da região DRMR da Vif do HIV-1 pela sequência SEMQ da Vif do SIVAGM. Poderemos levantar a hipótese que esta região da Vif pode estar envolvida na escolha do APOBEC que a Vif inibe