Regeneração óssea : a relevância dos novos biomateriais nas especialidades de estomatologia e cirurgia maxilo facial

Tese de doutoramento em Medicina (Cirurgia Maxilo-Facial), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007As novas técnicas de reabilitação oral, a necessidade de recuperação da forma e função perdida patologicamente, ou por traumatismos, são condicionadas pela presença ou ausência de osso na área maxilo facial. A utilização de enxertos de osso autólogo é considerada a melhor técnica para a recuperação do osso perdido. A morbilidade associada às técnicas de colheita de enxerto ósseo autólogo e a sua disponibilidade limitada no corpo humano, levou à investigação de novas metodologias de regeneração óssea. Aloenxertos de tecido ósseo, fosfatos cálcicos naturais, materiais sintéticos como as cerâmicas, biovidros, polímeros e compósitos foram utilizados com algum êxito em situações clínicas específicas. A descoberta de agentes indutores, como as BMP, veio trazer algum progresso à regeneração óssea. O preço elevado e o fraco conhecimento da sua acção noutros tecidos impediu até hoje o seu uso generalizado. A expansão e diferenciação celular, possível pelas tecnologias actualmente existentes, abriram o campo para a utilização de células mesenquimais (MSC). Estas células mostraram potencial de diferenciação in vitro, em osteoblastos, fibroblastos, mioblastos e adipocitos. É no âmbito da regeneração óssea com utilização de MSC que situamos o nosso trabalho. Foi nosso objectivo avaliar a regeneração óssea em defeitosósseos cranianos como resposta a dois tipos de materiais de preenchimento: hidroxiapatite reforçada com biovidro (HAGR) e o mesmo material servindo como transportador de MSC parcialmente diferenciadas, in vitro, em osteoblastos (HAGR+MSCOPD). A HAGR utilizada é um produto de patente Portuguesa, comercializada sob o nome Bonelike®. As propriedades da HAGR na regeneração óssea são conhecidas. A capacidade regenerativa óssea da HAG+MSCROPD em animais não tinha sido ainda testada, razão pela qual foi realizado este trabalho. As células foram obtidas da medula óssea da crista ilíaca do coelho através de aspiração com agulha. Depois de recolhidas as células foram isoladas seguindo protocolo de separação mecânica.Cumprido o protocolo de isolamento foi iniciado o processo de culturae subculturas celulares para diferenciação osteogénica. As célulasobtidas foram colocadas em meio de cultura para expansão ediferenciação osteoblástica (alfa-MEM com 1% pen/strep, 2 mM Lglutamina,20% FBS, 10mM Beta-glicerofosfato, 50 µg/ml ácidoascórbico e 100 nM dexametasona), em placas T75, e colocadas emcâmaras de cultura de CO2 à temperatura de 37º C, 7% CO2 ehumidade relativa de 90%-95%. Foram transplantadas para cada defeito 3.000.000 ±1.000.000 de células. Como controlos negativos e positivos foram utilizados respectivamente defeitos sem preenchimento e com osso autólogo. Avaliámos a regeneração óssea em 72 defeitos circulares na calote craniana de 36 coelhos New Zealand White com distribuição aleatória, na primeira, segunda e quarta semana. As peças obtidas após sacrifício dos animais foram: observadas macroscópicamente; radiografadas com radiologia digital directa (Kodak RVG 6000, Eastman Kodak Company, França); preparadas para observação histológica com técnica de osso não descalcificado (sistema Exakt protocolo de Donath) e observadas em estereomicroscópio (Nikon SMZ 1500) e microscópio óptico de campo claro (Nikon Eclipse 600). A quantificação do novo osso formado foi efectuada por histomorfometria (programa Bioquant® Nova) e tratamento estatístico (ANOVA com medições repetidas). Esta avaliação foi efectuada para toda a área do defeito e para uma área central pré definida. Esta última foi escolhida para se minorar o efeito osteogénico dependente das células do hospedeiro presentes nas margens do defeito. Pela avaliação macroscópica e histológica não se observam quaisquer reacções locais ou sistémicas aos materiais utilizados. Os animais recuperaram sem complicações da anestesia e cirurgia. A avaliação com radiologia digital directa mostrou a formação denovo osso, sobretudo nas margens do defeito mas foi pouco discriminativa nos defeitos em que se utilizaram partículas de HAGR que, devido à sua densidade elevada geram imagens de sobreposição. Através do exame histológico, em cortes coronais e horizontaisfoi possível avaliar a evolução temporal da regeneração óssea dosdefeitos. Confirmámos que os defeitos sem preenchimento epreenchidos com osso autógeno se comportaram como controlosnegativos e positivos. Observamos uma maior regeneração óssea nosdefeitos preenchidos com HAGR + MSCOPD quando comparados comos preenchidos apenas com HAGR. Foi confirmada a capacidadeosteocondutora da HAGR uma vez que os resultados obtidos sãosuperiores aos dos defeitos sem qualquer tipo de preenchimento. Aavaliação quantitativa por histomorfometria mostrou valores comdiferenças significativas relativas à relação entre os grupos, no tempo e inter relação grupos/tempo (p<0,005). Deste trabalho poderemos retirar as seguintes conclusões: o modelo animal escolhido pode ser considerado adequado; o material sintético utilizado não desencadeou qualquer reacção local avaliada pela observação macroscópica e histológica; os materiais sintéticos utilizados apresentaram propriedade osteogénicas; a adição de MSC parcialmente diferenciadas in vitro à HAGR melhora a capacidade osteogénica deste material na regeneração óssea de defeitos cranianos criados na calote craniana do coelho.The new techniques of oral rehabilitation and the need to restore the form and function lost due to patology or trauma, are conditioned by the presence or lack of bone in the maxillofacial area. The use of autologous bone grafting is considered the best technique for recovering the lost bone. The morbility associated to the autologous bone collection techniques prompted the investigation of new bone regeneration methodologies. Bone tissue allografts, natural calcium phosphates, synthetic materials such as ceramics, bioglass, polymers and composites were used with a certain amount of success in specific clinical situations. The discovery of inducing agents, such as the Bone Morphogenetics Proteins (BMP), allowed some progress in the field of bone regeneration. Until now, the generalized use of this procedure has been hindered by the high cost and the poor knowledge of the action exerted on other tissues. The expansion and celular differenciation, enabled by the modern technologies, have favoured the use of Mesenchymal Stem Cells (MSC). These cells have shown in vitro differenciation potencial, as well as in osteoblasts, in fibroblasts, myoblasts and adipocytes. The scope of our work lays on the bone regeneration using MSC partially differentiated cells. Our study aimed at evaluating bone regeneration in cranial bonedefects as a response to two types of filling materials: synthesizedhidroxiapatite with bioglass (HAGR) and the same material as MSCconductor, partially in vitro differentiated in osteoblasts(HAGR+MSCOPD). The HAGR used is a Portuguese patented product,commercially available under the name Bonelike®. HAGR boneregeneration properties are well known. The reason to conduct thiswork was based upon the fact that the HAGR+MSCOPD regenerativecapacity in animal bones had not been tested yet.The cells were obtained from the iliac crest bone marrow ofrabbits by fine needle aspiration. After the collection, the cells wereisolated according to a previous described mechanical separationprotocol. Once carried out the isolation protocol, celular culture and subculture procedures were initiated for osteogenic differentiation.The cells obtained were harvested for osteoblastic expansion anddifferentiation in culture medium (α-MEM with 1% pen/strep, 2 mM Lglutamine,20% FBS, 10mM ß-glycerophosphate, 50 µg/ml ascorbicacid and 100 nM dexametasone), then spread in T75 plates andplaced in CO2 culture chambers at 37ºC, with 7% CO2 and 90%-95%relative humidity. Each defect received a grafting of 3.000.000 ±1000000 cells.Defects with and without autologous bone filling were used asnegatives and positive controls, respectively.Bone regeneration was evaluated in 72 calvarial circular defectsof 36 New Zealand White rabbits, randomly distributed on the first,second and fourth week of the study.After sacrificing the animals, the pieces obtained were:macroscopically examined, X-ray screened using the direct digitalradiology technique (Kodak RVG 6000, Eastman Kodak Company,France); prepared for histological examination using the nondecalcified bone technique (Exakt system Donath protocol);screened by stereomicroscopy (Nikon SMZ 1500) and confocaloptical upright microscopy (Nikon Eclipse 600).New bone formation was quantified by histomorfometry(Bioquant ®Nova) and statistical analysis (ANOVA with repeatedmeasures). This evaluation was performed in the whole area of thedefect and in a predefined central area. The latter was selected inorder to minorize the osteogenic effect dependent of the host-cellslocated on the edges of the defect.The macroscopic and histological evaluation didn't reveal neitherlocal nor systemic reaction to the materials used. The animalsrecovered without complications from the anesthesy and surgery.New bone formation was shown by direct digital radiologyexamination, namely at the edge of the defects, but with poordiscriminative features for the defects using HAGR high densityparticles and creating superposed images.The evolution in time of bone regeneration within the defects was assess by histological examination of coronal and horizontal sections.It was confirmed that defects without filling and filled withautogenous bone behave exactly like negative and positive controls.A higher rate of bone regeneration was observed in bones filled withHAGR and MSCOPD when compared to those only filled with HAGR.The HAGR osteoconductor capacity was confirmed since it showedbetter results than defects with no filling. The histomorfometryquantitative evaluation revealed significantly different values inintergroups and time relationships ratio as well as in terms ofgroups/time interrelationship (p