Análise molecular de lectinas em sementes de leguminosas

Tese de doutoramento em Farmácia (Bromatologia), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2009As leguminosas, em particular as suas sementes, são uma excelente fonte de proteínas. Associados aos constituintes nutricionais as leguminosas exibem factores antinutricionais, entre os quais as lectinas. Muitos dos compostos antinutricionais poderão tornar a leguminosa tóxica para o homem e animais, mas essa manifestação poderá ser avaliada cientificamente. O isolamento destes compostos bioactivos tem levado à descoberta de compostos com actividade antimicrobiana (bacteriana, viral e fúngica), insecticida, anti-inflamatória, e com propriedade nutracêuticas, como, por exemplo, a γ-conglutina de Lupinus albus. Face à importância de compostos bioactivos, na utilização das leguminosas, decidiu-se enveredar pela pesquisa e estudo, de lectinas. Fez-se, inicialmente, o despiste da actividade hemaglutinante em diferentes fracções de diferentes órgãos, tendo-se seleccionado a fracção das albuminas totais, da semente seca, para o tremoço (Lupinus albus), e a fracção de globulinas totais, igualmente da semente seca para a ervilhaca, (Vicia sativa), como materiais de estudo. Para a Vicia sativa, procedeu-se ao fraccionamento por cromatografia de troca aniónica, e à caracterização das suas principais proteínas de reserva ( -,ß-, γ- e δ- vicininas), tendo-se detectado e isolado a δ-vicinina, uma proteína com intensa actividade hemaglutinante, de massa molecular de 47 kDa. Para o Lupinus albus, o fraccionamento das albuminas, por cromatografia troca aniónica seguida, de cromatografia de afinidade, permitiu, identificar e isolar, uma subunidade de massa molecular de 42 kDa (constituinte da γ-conglutina). A determinação da inibição da actividade hemaglutinante, das albuminas totais (ao que tudo indica, provocada pela subunidade de 42 kDa) pelos açúcares, possibilitou seleccionar a galactose, como o açúcar com maior acção inibitória (1,7×10-6 M). A determinação da especificidade da galactose, associada à especificidade, de ligação, da lectina de 42 kDa (subunidade) às membranas eritrocitárias, permitiu desenvolver uma nova metodologia, de funcionamento análogo ao de uma coluna de afinidade, mas com carácter muito mais abrangente, no isolamento e purificação de lectinas.The Leguminosae family of plants, specially their seeds, are an excellent source of proteins. Next to the proteins, legumes contain a variety of potentially toxic compounds, such as lectins. Many of these compounds may render the legume toxic for both man and animals and needs be scientifically evaluated. The purification of these bioactive compounds was an inducement to discover biomolecules with antimicrobial (bacterial, viral, and fungal), insecticidal and anti-inflammatory activities, or with nutraceutical properties, such as Lupinus albus γ-conglutin. As bioactive compounds are important in the use of legumes, lectins became the aim of this work. First, haemagglutinating activity was detected in distinct fractions of different organs, for each species: lupinus (Lupinus albus L.) and vicia (Vicia sativa L.). The albumin fraction, from dry seeds of lupinus, and the total globulins fraction, from the dry seeds of vicia, were selected as the biological materials. The total globulins from Vicia sativa were fractionated by anion exchange chromatography, and major the storage proteins (α-, ß-, γ- e δ- vicinins) characterized. e δ-Vicinin, a protein displaying a high haemagglutinating activity, with a molecular mass of 47 kDa, was identified and purified. The albumins from Lupinus albus were fractionated by anion exchange chromatography, followed by affinity chromatography, which allowed the identification and purification of a protein subunit with a molecular mass of 42 kDa. The haemagglutinating activity (presumably derived from the 42 kDa subunit) inhibition assay for albumins with sugars, identified galactose as the sugar with the highest inhibitory action (1,7×10-6 a 1,37×10-4 M). The identification of the galactose specific-lectin activity of the 42 kDa protein subunitity, associated with the binding specificity of this lectin to the erythrocyte membrane, led to the development of a new methodology, comparable to affinity chromatography, but with a mutch broades action spectrum, in lectin purification