Outils microfluidiques pour la maladie d'Alzheimer : étude de l'agrégation de l'amyloïde-bêta

Le vieillissement de nos sociétés provoque une augmentation du nombre de personnes atteintes de maladies neuro-dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (5% des plus de 65 ans et 15% des plus de 85 ans) ou de Parkinson. Les personnes atteintes nécessitent un suivi et une prise en charge importante de la part de leurs proches ou d'organismes spécialisés. Face à ce constat, il apparaît nécessaire de mieux appréhender les mécanismes de développement de ces maladies qui sont encore méconnus, dans le but final de trouver des traitements efficaces. La maladie d'Alzheimer est caractérisée par des pertes neuronales et synaptiques dans des zones précises du cerveau ce qui induirait les troubles de la mémoire et du comportement observés chez les malades. L'une des hypothèses, pour expliquer ces lésions cérébrales, est l'agrégation d'une protéine au niveau neuronal, l'amyloïde-bêta. Ces agrégats vont conduire à la mort neuronale, probablement par divers mécanismes. L'agrégation de cette protéine forme des plaques séniles en surfaces des neurones, une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. De nombreuses études, s'appuyant sur des méthodes classiques de la biochimie, ont permis de montrer que de multiples facteurs influaient sur le mécanisme d'agrégation (concentration en amyloïde-beta, pH, présence d'ions métalliques et autre composés, température, propriétés des surfaces). De plus, la cinétique d'agrégation est dynamique, complexe, difficilement contrôlable par les outils classiques de la biologie moléculaire. Dans ce contexte, cette thèse présente une approche originale, basée sur l'utilisation de l'outil microfluidique (manipulation de fluides au sein de systèmes microfabriqués), pour appréhender ce problème. Pour cela, nous avons développé deux types de puces microfluidiques complémentaires. La première a pour but de cribler différentes conditions réactionnelles afin de connaître les facteurs importants et les seuils de concentration critiques. Dans ce but, nous avons réalisé des systèmes permettant de réaliser des gradients de concentration linéaire, grâce auxquels nous avons essentiellement testé l'impact de la concentration en amyloïde-bêta sur l'agrégation. Ces expériences nous ont permis de montrer l'existence d'un seuil de concentration. La seconde approche est complémentaire de la première, elle a pour but de s'intéresser à la cinétique de réaction. Les puces sont basées sur le principe de réaction-diffusion, cela nous permet de mesurer tout d'abord le coefficient de diffusion du peptide seul (sans agrégation) puis durant l'agrégation. La comparaison des deux situations nous renseigne sur la taille des agrégats. Ces expériences nous ont permis de mesurer le coefficient de diffusion pour différentes molécules (fluorescéine, rhodamine B) et peptides modèles. Concernant l'agrégation, l'adsorption de la protéine sur les parois des canalisations limite encore l'interprétation de nos expériences préliminaires en termes de cinétique. A travers cette thèse, nous avons développé des outils microfluidiques permettant l'étude de l'agrégation de l'amyloïde-bêta. D'une part, nous avons réalisé un système permettant le criblage de nombreuses conditions réactionnelles qui peut être appliqué au domaine du génie chimique. D'autre part, une configuration de réaction-diffusion vise à remonter à la cinétique d'agrégation. La principale limitation actuelle des systèmes est le contrôle des conditions d'adsorption des protéines sur les parois.The aging of our society leads to a development of neurodegenerative disease like Alzheimer's disease. Patients require an important caring by their family and specialized organisms. Moreover, the mechanisms which lead to the disease are not very well known yet, and progresses in the understanding of these should help to find new treatment. Memory and compartmental troubles associated to Alzheimer's disease come from neuronal and synaptic losses. A scenario proposed to explain those losses is the aggregation of a small protein, beta-amyloid, in neuronal area. It leads to the formation of senile sheets at neuron surface which is characteristic of Alzheimer's disease. The reaction is multifactor: it is influenced by beta-amyloid concentration, metallic ions, temperature, surface's property. Furthermore, the classical tools of biochemistry can hardly assess the first kinetic steps of aggregation. In this context, this thesis describes original microfluidic tools to study beta-amyloid aggregation, according to two approaches. In the first one, concentration gradients combined to on-chip triggering of the aggregation enable screening reaction's conditions. We have essentially tested the impact of beta-amyloid concentration and we show a concentration threshold. The second design is devoted to studying the reaction kinetics. We used reaction-diffusion chip to measure the diffusion coefficient with and without aggregation. It should enable measuring the evolution of the size of aggregates. We have successfully determined the diffusion coefficient for some model beta-amyloid peptides. However, in aggregating conditions, adsorption of the peptide on the wall still prevents quantitative interpretation of our experiments. With this thesis, we have developed microfluidics tools to study beta-amyloid aggregation. In the first part we develop a chip able to screen many reaction conditions. In the second part, we make reaction-diffusion chip to have information about aggregation's kinetics. The main limitation of this chip is the control of peptide interaction with surfaces