Réseaux géniques initiés par NEUROG2 dans la moelle épinière en développement : analyse globale et étude de la régulation de PAX6

Le système nerveux central est un réseau de circuits élaborés formé par des neurones par lesquels circule l'influx nerveux et des cellules de soutien, les cellules gliales. Initialement, la moelle épinière embryonnaire est constituée de cellules souches en prolifération capables de produire tous les types neuraux. Au cours de la neurogenèse une combinaison de signaux va restreindre les potentialités de ces cellules. La différenciation d'une cellule souche en neurone repose sur une séquence stéréotypée d'évènements d'arrêt de prolifération, de spécification et de différenciation des cellules neurales progénitrices. La caractérisation des mécanismes qui régissent ces différents évènements et les coordonnent est cruciale pour comprendre comment à partir d'une cellule souche, l'embryon peut générer la diversité des cellules qui composent le système nerveux central. Les gènes proneuraux sont des acteurs majeurs de la neurogenèse. Ils confèrent aux cellules qui les expriment un destin neuronal et contrôlent la sortie du cycle cellulaire, la spécification et la différenciation en neurone de ces cellules. Un des enjeux majeurs à l'heure actuelle est d'identifier les acteurs moléculaires mis en jeu en aval des proneuraux pour réaliser ces différentes fonctions. Mon travail de thèse a consisté à étudier les événements moléculaires mis en jeu en aval du proneural NEUROG2 dans la moelle épinière en développement. Malgré le rôle prépondérant de NEUROG2 dans la formation des neurones moteurs de la moelle épinière, peu de ses gènes cibles étaient identifiés dans ce tissus. J'ai donc développé une approche à grande échelle pour identifier l'ensemble des gènes de réponse précoce à NEUROG2 dans la moelle épinière. Cette approche m'a permis de caractériser les réseaux géniques mis en jeu pour initier la cascade d'événements moléculaires nécessaires à sa fonction. J'ai notamment montré que NEUROG2 contrôle la sortie du cycle cellulaire des progéniteurs neuraux en régulant négativement l'expression des cyclines spécifiques des phases G1 et S du cycle cellulaire, ce contrôle se faisant en amont de l'activation du CKI p27KIP1. Un deuxième objectif de ma thèse a été d'étudier en détail les mécanismes moléculaires par lesquels NEUROG2 réprime l'expression du facteur de spécification PAX6. Pax6 est un facteur de transcription qui contrôle à la fois la spécification des neurones ventraux et le moment où les neurones se différencient. Le maintien de ce gène dans les précurseurs de neurones empêche leur différenciation car il contrecarre dans ces précurseurs l'activité proneurale de NEUROG2 (Bel-Vialar 2007). Il était établi que Pax6 contrôle positivement l'expression de NEUROG2 dans la partie ventrale du tube neural et que de forts niveaux de NEUROG2 éteignent en retour l'expression de PAX6 dans les précurseurs de neurones. J'ai montré que NEUROG2 agit à la fois sur le transcrit et la protéine PAX6 et que la répression du transcrit Pax6 se fait via l'activation d'un gène intermédiaire X. Pour identifier cet intermédiaire, j'ai testé plusieurs candidats potentiels et à l'heure actuelle le gène PROX1 se présente comme le meilleur candidat. L'ensemble de mes travaux, au-delà de la mise en évidence d'un contrôle de NEUROG2 sur les cyclines des phases G1 et S du cycle cellulaire et de la caractérisation des mécanismes de répression de PAX6, a permis d'identifier un grand nombre de nouveaux gènes, activés en aval de NEUROG2, dont la fonction dans les différentes étapes de neurogenèse reste à élucider.The central nervous system is a complex network formed of neurons that processes and transmits the nerve impulse and of glial cells that maintain homeostasis, form myelin, and provide support and protection for neurons. Initially, the embryonic spinal cord consists of proliferating stem cells capable of producing all the neural cells types and during neurogenesis a combination of signals will progressively restrict the potential of these cells. Neurogenesis involves a stereotyped sequence of events that trigger proliferation arrest, specification and differentiation of neural progenitor cells. The characterization of the mechanisms governing and coordinating these events is crucial to understand how from a pluripotent stem cell, the embryo can generate the diversity of cells that make up the central nervous system. Proneural genes are major players of neurogenesis. They confer cells a neuronal fate and trigger cell cycle arrest, specification and differentiation of neuronal progenitors. A major challenge is now to identify the molecular players involved downstream of proneurals to perform and coordinate these different events. In this context, the aim of my PhD was to identify the gene networks initiated downstream the proneural NEUROG2 in the developing spinal cord. Indeed, despite its important role in motor neurons production, only a handful of NEUROG2 targets genes have been identified in the spinal cord. To fill this gap, I developed a large scale approach to identify the entirety of genes modulated shortly after NEUROG2 activation. This approach allowed me to characterize gene networks that trigger the different aspects of NEUROG2 function. In particular, I showed that NEUROG2 controls cell cycle exit of neuronal precursors by extinguishing the expression of a subset of cyclins that are specific of the G1 and S phases of the cell cycle and that this event takes place upstream of the activation of the CKI p27kip1. A second objective of my thesis was to study in detail the molecular mechanisms by which NEUROG2 represses the expression of the PAX6 gene. PAX6 is a transcription factor that controls both the specification of ventral neurons and the time when neurons differentiate. Maintaining this gene in neural precursors prevents their differentiation because it counteracts NEUROG2 proneural activity in these precursors (Bel Vialar 2007). It was established that PAX6 positively controls the expression of NEUROG2 in the ventral neural tube and that inn turn high levels of NEUROG2 extinguish the expression of PAX6 in neural precursors, hence triggering neuronal differentiation. I showed that NEUROG2 reduce both the transcript and PAX6 protein levels and that the repression of PAX6 transcripts is achieved via the activation of an intermediary gene. To identify this intermediary gene, I tested several potential candidates and at the moment the best candidate left is the PROX1 transcription factor. Altogether my work, beyond the demonstration of a control of NEUROG2 on G1 and S phases cyclins of the cell cycle and the characterization of the mechanisms of PAX6 repression, allowed identifying a large number of new genes, activated downstream of NEUROG2, whose elucidation of function in different stages of neurogenesis will provide important information in the aim of better understanding the neurogenesis process and elaborating new treatments of neuropathologies