Caractérisation de la fonction moléculaire du petit ARN nucléolaire H/ACA, snR30, dans la biogenèse des ribosomes chez Saccharomyces cerevisiae

Les petits ARN nucléolaires (snoARN) à boîtes H/ACA représentent une classe d'ARN non-codant très abondante, très conservée mais aussi extrêmement diversifiée. Tandis que de nombreux ARN à boîtes H/ACA sont responsables de la pseudo-uridylation des ARN ribosomiques et des snARN de la machinerie de l'épissage, le groupe grandissant des ARN "orphelins" participe aux clivages nucléolytiques des précurseurs ribosomiques (pré-ARNr), à la synthèse des télomères et très certainement à d'autres processus nucléaires. Appartenant à ce dernier groupe, le petit ARN nucléolaire snR30 est connu depuis longtemps comme étant essentiel à l'accumulation de l'ARNr 18S chez S. cerevisiae. En revanche, les mécanismes moléculaires à la base de cette fonction restent encore inconnus. Grâce à une approche à la fois génétique et biochimique, nous avons démontré que durant la maturation des pré-ARNr, deux séquences conservées présentes dans la tige-boucle à l'extrémité 3' de snR30 s'hybrident avec deux courtes séquences du pré-ARNr localisées au niveau d'une région interne de l'ARNr 18S, uniquement présente chez les Eucaryotes. Cette nouvelle interaction entre snR30 et l'ARNr 18S est essentielle à la production de ce dernier et ils forment une structure snoARN-ARN cible totalement nouvelle pour les snoARN à boîtes H/ACA. D'autre part, nous avons aussi mis en évidence qu'outre les motifs de reconnaissance de l'ARNr 18S, la partie distale de la tige-boucle à l'extrémité 3' de snR30 contient des séquences additionnelles essentielles pour la maturation de l'ARNr 18S qui pourraient probablement être le lieu de fixation de protéines indispensables à la maturation du pré-ARNr. De précédentes expériences ont révélé la présence de trois protéines spécifiques à la ribonucléoparticule de snR30 en complément des quatre protéines communes à tous les snoARN à boîtes H/ACA. Dans un dernier temps, nous avons donc mis au point une nouvelle technique de purification par affinité qui, à terme, pourrait être un bon outil pour identifier les protéines spécifiques de la ribonucléoparticule de snR30 et ainsi pourrait permettre d'approfondir le mécanisme d'action de ce snoARN à boîtes H/ACA dans les étapes de clivages nucléolytiques du pre-ARNr.Ribosome synthesis takes place in the nucleolus where many box H/ACA snoRNAs direct pseudouridylation of rRNAs. The U17/snR30 box H/ACA snoRNA, instead of directing rRNA modification, functions in the nucleolytic processing of the precursor rRNA (pre-rRNA) and is required for accumulation of mature 18S rRNA. We have identified two short sequence motifs in the 18S rRNA that can base-pair with two evolutionarily conserved sequences elements, m1 and m2 motifs, of the yeast Saccharomyces cerevisiae snR30. Mutations in the 18S sequences disrupting the base-pairing with the m1 or m2 motifs of snR30 inhibit the accumulation of the mature 18S rRNA. However, compensatory mutations introduced into m1 or m2 motifs of snR30 restore 18S rRNA processing. The m1 and m2 motifs that constitute the opposite strands of an internal loop of U17/snR30 base-pair with short 18S sequences preceding and following a conserved stem-loop structure in the middle of the 18S rRNA. Further functional mapping of yeast snR30 indicated that its 3'-terminal hairpin contains additional essential elements. Thus I developed a novel tandem affinity purification method in order to identify the putative snR30-specific snoRNP proteins