Caractérisation enzymatique de la protéine FadD32 de M.tuberculosis, impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques et cible potentielle d'antituberculeux, ainsi que d'autres enzymes paralogues

La recrudescence de la tuberculose, favorisée par l'épidémie de VIH et associée à l'apparition de souches résistantes aux antibiotiques, souligne la nécessité de déterminer les mécanismes moléculaires de sa pathogénicité et de développer de nouveaux antibiotiques. Le génome de Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose recèle un grand nombre de gènes impliqués dans le métabolisme lipidique, dont les gènes fadD qui codent pour des acyl-CoA synthétase putatives. Nous avons réalisé la caractérisation enzymatique de protéines FadD impliquées dans la biosynthèse des constituants de l'enveloppe du bacille tuberculeux, et plus particulièrement dans celle des acides mycoliques. Ces acides gras à longues chaînes, alpha-ramifiés et beta-hydroxylés sont des composés majeurs et spécifiques de l'enveloppe des Corynebacterinae. Ils sont essentiels à la survie des mycobactéries. Ainsi, les enzymes intervenant dans la voie de biosynthèse des acides représentent des cibles potentielles d'antituberculeux. Parmi ces protéines, l'enzyme FadD32, impliquée dans l'étape clé de condensation "mycolique" entre deux acides gras, est essentielle à la croissance des mycobactéries. La caractérisation enzymatique de FadD32 a permis de mettre en évidence son activité acyl-ACP Ligase et le mécanisme réactionnel particulier de l'étape de condensation avec sa protéine partenaire la condensase Pks13. Un inhibiteur, analogue de substrat, de FadD32 a été testé avec succès sur l'enzyme, mais également sur la biosynthèse mycolique et la croissance bactérienne. Nous avons développé un essai enzymatique de FadD32 adaptable au criblage à haut débit. Cet essai servira in fine, à tester la chimiothèque d'inhibiteurs d'un partenaire industriel.The resurgence of tuberculosis, facilitated by the HIV epidemic and associated with the emergence of antibiotic-resistant strains, stresses the need to determine the molecular mechanisms of pathogenicity and to develop new antibiotics. The genome of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, contains a large number of genes involved in lipid metabolism, including genes coding for putative fadD acyl-CoA synthetases. We performed the enzymatic characterization of fadD proteins involved in the biosynthesis of the tubercle bacillus envelope constituents, especially the mycolic acids. These long-chain fatty acids, alpha-branch and beta-hydroxy are major and specific compounds of the Corynebacterinae envelope. They are essential to the survival of mycobacteria. Thus, enzymes involved in the biosynthesis of these acids represent potential targets for TB drug development. Among these proteins, the enzyme FadD32, involved in the key stage of "mycolic" condensation between two fatty acids, is essential to the growth of mycobacteria. The enzymatic characterization of FadD32 helped to highlight the reaction mechanism of its acyl-ACP Ligase activity and particularly the condensation step with its partner protein the condensase Pks13. An inhibitor, substrate analog of FadD32 was successfully tested on the enzyme, but also on mycolic biosynthesis and bacterial growth. We have developed an enzymatic test FadD32 adaptable to high throughput screening. This assay will ultimately serve to test the inhibitors chemical library of an industrial partner