Imagerie de fluorescence d'événements moléculaires et cellulaires associés au cancer au sein d'animaux vivants

L'imagerie de fluorescence permet de réaliser le suivi spatiotemporel d'événements fluorescents définis dans le temps et l'espace à l'échelle de la cellule, du tissu ou de l'animal vivant. Le développement de son utilisation pour la détection de cellules cancéreuses repose en partie sur la définition de sondes permettant à la fois le ciblage et la détection. Le premier axe de mon travail de thèse concerne donc le développement de sondes fluorescentes pour le diagnostique de cellules cancéreuses in vivo. Ensuite, le second axe repose sur l'étude du transfert de molécules thérapeutiques in vitro et in vivo dans des cellules tumorales par électroperméabilisation. Dans un premier temps, l'objectif est de développer une molécule " intelligente " pour la détection de cellules cancéreuses dans un organisme vivant par imagerie de fluorescence non invasive. Notre stratégie repose sur l'utilisation de molécules organiques branchées appelées dendrimères, qui peuvent porter plusieurs fonctions permettant le ciblage et la détection. En collaboration avec l'équipe du Dr Majoral, nous avons donc tenté de greffer plusieurs marqueurs tumoraux et plusieurs fluorochromes afin d'augmenter respectivement sa spécificité pour les cellules cancéreuses B16F10 et le rapport signal/bruit pour leur détection in vivo. Malheureusement, la nature chimique des dendrimères n'a pas permis d'obtenir une molécule fonctionnelle. En effet, ceux ci n'étant solubles qu'en présence d'une quantité élevée de solvant organique, nous avons rencontré des problèmes de dénaturation des sondes biologiques (anticorps) que nous tentions de greffer. En parallèle, différents dendrimères (cationiques, anioniques, neutres, fluorescents) non fonctionnels ont été testés sur nos cellules afin de déterminer le meilleur candidat utilisable in vivo. Des problèmes de stabilité de la fluorescence et de toxicité ont été mis en évidence. Pour résoudre ces problèmes, nous avons enfin élaboré avec l'équipe de chimistes, des dendrimères portant des polyéthylènes glycol pour les solubiliser en milieu aqueux et les rendre biocompatibles. Ces derniers n'étant pas cytotoxiques, cette approche permettra d'élaborer un dendrimère fonctionnalisable en milieu aqueux. Les ARN interférents présentent un intérêt majeur pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses car une fois transférés dans le cytoplasme des cellules, ils régulent spécifiquement l'expression d'un gène cible. Cependant, la membrane plasmique des cellules est une barrière imperméable et ses molécules thérapeutiques ont besoin d'atteindre leur cible intracellulaire pour être activent. L'objectif de ce second axe de recherche est d'étudier par imagerie de fluorescence, le mécanisme biophysique qui régit le transfert de siRNA, lorsqu'on électroperméabilise des cellules cancéreuses in vitro et in vivo. Pour cela, nous utilisons un siRNA portant un fluorochrome et dont la séquence nucléotidique cible l'ARN messager de la protéine GFP qui est exprimée constitutivement et de façon stable dans notre modèle cellulaire. Ces travaux montrent que l'électrotransfert du siRNA induit une régulation transitoire du gène ciblé in vitro et in vivo. Grâce à l'imagerie confocale et à l'échelle de la cellule unique, il apparaît que le siRNA traverse librement la membrane plasmique des cellules, sans interagir avec elle (comme le fait l'ADN plasmidique), uniquement en présence d'un champ électrique perméabilisant, et qu'il est transféré dans le cytoplasme des cellules par un mécanisme d'électrophorèse. Enfin, sa biodistribution dans les tumeurs chez le petit animal par des techniques d'imagerie de fluorescence est déterminée. Nos résultats obtenus in vitro et in vivo sont concordants, nous observons une localisation cytoplasmique du siRNA qui permet une régulation transitoire de l'expression du gène cible efficace pendant 6 jours. Nous montrons que l'électroperméabilisation permet un traitement local, homogène et efficace dans les cellules tumorales.Fluorescent imaging allows one to monitor spatio-temporal fluorescent events occurring in cells, tissue or living animals and defined in time and space. The development of its use for detecting cancerous cells lies in part in the advancement of probes designed to target and detect. The first axis of my thesis work therefore concerns the evolution of fluorescent probes for the diagnosis of cancer cells in vivo. The second axis will evolve around the study of the transfer of therapeutic molecules in vitro and in vivo to tumoral cells via electropermeabilization. Firstly, the main objective is to develop a "smart molecule" for detecting cancer cells in living organisms by non-invasive fluorescent imaging. Our strategy is based on the use of branched organic molecules called dendrimers, which among their multiple functions allow targeting and detection. In collaboration with Dr. Majoral's team, we attempted to bind several tumour markers to various fluorescent dyes, in order to increase their specificity for B16F10 cancer cells and their signal to noise ratio for detection in vivo. Unfortunately, the chemical nature of dendrimers did not allow us to obtain a functional molecule. Indeed, as they are only soluble in the presence of a high quantity of organic solvent, we encountered a number of problems, due to the denaturing of the biological probes (antibodies) during the binding reaction. In parallel, a variety of non functional dendrimers (cationic, anionic, neutral and fluorescent) were tested on cells in order to determine the most viable candidate for use in vivo. However, we identified problems with the stability of the fluorescence and the toxicity. To solve these issues, with the assistance of a team of chemists, we developed dendrimers bearing polyethylene glycol to enable their dissolution in aqueous environments and make them biocompatible. As these are not cytotoxic, this approach will allow us to elaborate a dendrimer that is functional in an aqueous environment. The interfering RNA is a major interest with regards to the development of new anti-cancer therapy because, once transferred into the cell cytoplasm, they specifically regulate the expression of the target gene. However, the plasma membrane of cells is an impermeable barrier and its therapeutic molecules need to reach their intracellular target to be active. The objective of the second axis of my research is to study, using fluorescent imaging, the biophysical mechanisms governing the siRNA's transfer when the cancer cells are electropermeabilized in vitro and in vivo. To this purpose, we use a fluorochrome labelled siRNA whose nucleotide sequence targets the mRNA of the EGFP protein, which is constitutively and stably expressed in our cancer cell model. These studies demonstrate that the siRNA electrotransfer induces a transient regulation of the targeted gene in vitro and in vivo. Using confocal imaging at single cell level, we demonstrate that the siRNA throught plasma membrane of cells, without interacting with them (as does plasmid DNA), only, in presence of a permeabilizing electric field and that it is transferred into the cell cytoplasm by electrophoresis. Finally, its biodistribution into the tumors of small animals is determined by fluorescent imaging methods. Our in vitro and in vivo results are concordant, we can observe the cytoplasmic localization of the siRNA, which allows the transient regulation of the expression of the target gene for six days. We therefore demonstrate that electropermeabilization allows a local, homogenous and efficient treatment of tumors