Development and application of molecular tools for the detection of the human pathogenic protozoan Giardia, Cryptosporidium and Toxoplasma

Es besteht ein enormer Bedarf an der Entwicklung effektiver molekularer Methoden, die die Nachteile bisheriger Nachweisverfahren für parasitäre Protozoen wie Giardia, Cryptosporidium und Toxoplasma überwinden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung der Loop mediated-isothermal-amplification (LAMP) Technik zum Nachweis von Cryptosporidium und Toxoplasma. Darüber hinaus wurde eine phylogenetische Analyse von aus Haustieren isolierten Giardia und Cryptosporidium durchgeführt. SNP basierende SAM-LAMP-Methode für Cryptosporidium Das auf der Amplifizierung des SAM-Gens basierende SNP- (single nucleotid polymorphism-) LAMP-Verfahren wurde anhand der entsprechenden Nukleotid-sequenzen für den spezifischen Nachweis der wichtigsten humanpathogenen Cryprosporidium-Arten (C. parvum, C. hominis und C. meleagridis) entwickelt, anschließend in Wasser- sowie klinischen und Tierproben angewendet. Für die Speziescharakterisierung der Proben wurde die Methode mit zwei nPCR-Methoden verglichen, die auf dem Nachweis des SSU rRNA-Gens mit der Amplifizierung von 435 bp und einer 850 bp langen polymorphen Regionen des Gens beruhen. Das auf SNP basierende SAM-LAMP-Verfahren wurde mit den Ergebnissen des Immunofluoreszenz-Tests (IFT) für Cryptosporidium und mit dem zuvor entwickelten GP60-LAMP-Verfahren zum ausschließlichen Nachweis von C. parvum verglichen. Die ermittelte Nachweisgrenze von 800 fg/µl entspricht 0,1 Cryptosporidium- Oozysten. Das entwickelte Verfahren wurde zunächst an 53 Wasserproben, die mit einer bekannten Anzahl an Cryptosporidium-Oozysten kontaminiert wurden, getestet. Die Sensitivität bei dem LAMP-Verfahren betrug 100% für die aufgestockten Proben, während die Sensitivität beider PCRs bei nur 3% und 7% lag. Bei den gleichen ursprünglichen (natürlichen) Proben wurden mittels auf SNP basierendem SAM-LAMP-Verfahren 50% und mittels GP60-Verfahren 24% Cryptosporidium DNA-Positive ermittelt; mit den nPCR Verfahren wurden hingegen nur 5% bzw. 7% Positivergebnisse generiert. Von 15 Wasserproben aus Thailand waren 12 (80%) positiv; ebenso positiv waren 4 von 8 (50%) Muschelproben, 11 von 44 (25%) Stuhlproben von HIV/AIDS Patienten und 12 von 22 (55%) tierischen Fäkalproben. Mit dem GP60-LAMP-Test und den beiden nPCR-Verfahren konnte vergleichsweise eine geringere Anzahl an positiven Proben ermittelt werden als durch SNP-basierende LAMP-Verfahren. Unter den durch Sequenzanalyse identifizierten Arten aus den untersuchten Proben war C. parvum am häufigsten, gefolgt von C. hominis in einer Muschelprobe, C. andersoni in einer tierischen Fäkalprobe und C. fragile in einer Wasserprobe. B1 und TgOWP LAMP-Methode für den Nachweis von Toxoplasma in Wasserproben Das auf der Amplifizierung der B1 und TgOWP-Gene basierende LAMP-Verfahren wurde für den schnellen Nachweis von Toxoplasma gondii in Wasserproben entwickelt und evaluiert. Die Nachweisgrenze der LAMP lag für beide Gene bei 0,1 Tachyzoiten-DNA. Das LAMP-Verfahren wurde vorher evaluiert und an 26 mit Toxoplasma-Oozysten aufgestockten Wasserproben mit der nested PCR verglichen. Die LAMP-Sensitivität betrug 100%, hingegen erreichte die nPCR der gleichen Proben nur 53.8% bei den gleichen aufgestockten ursprünglichen Wasserproben. Der Vergleich von IFT, LAMP und nPCR anhand von 52 ursprünglichen Wasserproben zeigte, dass 25 (48%) der mittels LAMP untersuchten Proben und keine mit IFT–Verfahren untersuchten Proben positiv waren, während nPCR- untersuchte in 7 (13,5%) der Proben generiert wurden. Haustierinfektionen und phylogenetische Analyse von Giardia und Cryptosporidium Die molekulare Diagnose von Giardia-Zysten und Cryptosporidium-Oozysten von Haustieren mit Ursprung aus Deutschland mittels nPCR und Sequenzanalyse war ein Teilgegenstand dieser Arbeit. Die Tierkotproben wurden im Anschluss an die Amplifizierung des Glutamat-Dehydrogenase-Locus (GDH Locus) auf das Vorhandensein von Giardia und die SSU-rRNA auf das Vorhandensein von Cryptosporidium untersucht. Von den 81 untersuchten Hunden und 19 Katzen wurde Giardia Assemblage A in Isolaten von fünf Hunden und zwei Katzen identifiziert. Bei Cryptosporidium-Isolaten aus einem Hund und einer Katze handelte es sich jeweils um C. parvum. In einem Hundeisolat lag eine Mischinfektion von C. parvum und Giardia Assemblage A vor. Diese Ergebnisse liefern einen deutlichen Hinweis darauf, dass die anthropozoonotischen Krankheitserreger Giardia spp. und Cryptosporidium spp. in Haustieren ein mögliches Infektionsreservoir für die Populationen von Mensch und Tier darstellen. Im Vergleich zu anderen molekularbiologischen Methoden ist das LAMP-Verfahren wegen seiner hohen Sensitivität und Spezifität eines der besten molekulardiagnostischen Verfahren zum Nachweis der humanpathogenen Protozoen Cryptosporium und Toxoplasma in Umweltproben, klinischem Material und Nahrungsmitteln. Die Anwendung der LAMP-Technik, kombiniert mit der PCR-Sequenzierung, kann zu einem schnellen Speziesnachweis, zur Differenzierung von für die Bevölkerung gesundheitsrelevanten Spezies sowie zur Identifizierung von Kontaminationsquellen dienen. Die LAMP-Anwendung hat das Potenzial, ein Werkzeug für den schnellen Nachweis dieser wichtigen anthropozoonotischen Spezies, für die menschliche und tierische Wirte anfällig sind, zu sein. Diese Methode kann dazu beitragen, der Kontrolle und Prävention von Krankheiten zu dienen und das Gesundheitsrisiko für die Bevölkerung durch nahrungsmittel- und wasserbürtige (Oo)zysten einzuschätzen