Identifizierung und Charakterisierung neuer Verzweigungsregulatoren durch Verwendung natürlicher Variation in Arabidopsis thaliana

Die Sprossarchitektur höherer Pflanzen wird hauptsächlich durch die Aktivität des Sprossapikalmeristems (SAM) festgelegt. Dieses bestimmt während der pflanzlichen Entwicklung die Bildung von Blättern entlang der Sprossachse und die Initiation lateraler Meristeme (AM) in Achseln der Blätter, zur Bildung sekundärer Wachstumsachsen. Die Initiation axillärer Meristeme wird in Arabidopsis durch zwei, partiell redundante Stoffwechselwege über die Gene LATERAL SUPPRESSOR (LAS) und REGULATOR OF AXILLARY MERISTEM (RAX) reguliert. Dabei ist die Funktion von LAS essentiell für die Anlage von AMs während der vegetativen Entwicklung und las Mutanten bilden keine Seitentriebe aus Rosettenblattachseln. Zur Identifizierung neuer Verzweigungsregulation wurde die natürlich vorkommende, genetische Variation verschiedener Arabidopsis Ökotypen in einem sogenannten „second-site modifier screen“ genutzt. Hierfür wurde die las Mutante im Ökotyp Columbia zu sechs verschiedenen Ökotypen gekreuzt und die las homozygoten F2 Nachkommenschaften phänotypisch charakterisiert. In fünf der sechs F2 Populationen konnte ein verstärkter las Verzweigungsdefekt in Stängelblattachseln ermittelt werden und ausgewählte F2 Kandidaten wurden für Rückkreuzungen mit dem las Elter verwendet. Die Analyse der segregierenden BC1F1 Populationen zeigte eine Korrelation zwischen dem verstärkten las Verzweigungsdefekt und einem spätblühenden Phänotyp, insbesondere in Populationen aus Kreuzungen mit den Ökotypen Kyoto und C24. Nachkommen der Kreuzung las/C24 zeigten insgesamt die stärksten Defekte in der Anlage von Lateralmeristemen und wurden für weitere Analysen verwendet. Die Grobkartierung des verantwortlichen Locus unter Verwendung eines AtSNPtile1 Array, sowie die weitere Feinkartierung in BC3F2 Populationen, identifizierte fünf Kandidatengene in einer 13kb Region im oberen Bereich des kurzen Arms auf Chromosom IV und beinhaltete den dominanten Blühzeitpunktregulator FRIGIDA (FRI). In Arabidopsis wird die Regulation des Blühzeitpunkts maßgeblich durch die Interaktion der Regulatoren FLOWERING LOCUS C und FRI beeinflusst, wobei FRI positiv die Expression von FLC reguliert und dadurch die Blühinduktion vor der Vernalisation verhindert. Im Columbia Hintergrund der las Mutante ist diese Interaktion unterdrückt, da Columbia nur ein aktives FLC, jedoch ein inaktives FRI Allel trägt. Um den Einfluss von FRI auf die Anlage von Lateralmeristemen zu untersuchen, wurden las und las rax1 Mutanten zu der Linie FRI (SF-2) in Columbia gekreuzt, die aktive FRI Allele aus dem Ökotyp San Feliu-2 besitzt. Homozygote Nachkommen der Kreuzung zeigten kein von las abweichendes Verzweigungsmuster. Die verzögerte Blühinduktion durch Interaktion von FRI und FLC per se ist somit nicht für einen Verzweigungsdefekt während der reproduktiven Entwicklung verantwortlich. Pflanzen der Linie las rax1 FRI hingegen zeigten eine nahezu vollständige Unterdrückung der Initiation axillärer Meristeme entlang der Sprossachse. Für weitere Analysen wurden las und las rax1 Mutanten zusätzlich zu mutanten Allelen der Blühzeitpunktregulatoren constans und leafy gekreuzt. Mutationen in CONSTANS führten zu keinem veränderten Verzweigungsmuster der las Mutante, wohingegen las rax1 co Dreifachmutanten die gleichen Defekte in der Anlage von Lateralmeristemen widerspiegelten wie Pflanzen der Linie las rax1 FRI. Im Gegensatz zu Pflanzen der Mutanten las FRI und las co, ließen las lfy Doppelmutanten eine enorme Verstärkung des las Verzweigungsdefekts in Stängelblattachseln während der reproduktiven Entwicklung erkennen (siehe auch Clarenz, 2004). RNA-in-situ- Hybridisierungen und quantitative Real-Time-PCR Analysen des R2R3 Myb-Transkriptionsfaktors RAX1 zeigten, dass die erhöhte RAX1 Expression nach der Blühinduktion abhängig ist von der Funktion des Transkriptionsfaktors LEAFY. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Initiation axillärer Meristeme während der reproduktiven Entwicklung durch einen dritten Stoffwechselweg reguliert wird, welcher durch die Aktivität von Blühzeitpunktregulatoren wie FRIGIDA, über LEAFY die Aktivität von Verzweigungsregulatoren wie RAX1 und LAS steuert